רקמות לב תלת-ממדיות שהונדסו ביולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע התגלו כמודלים מבטיחים לחקר שריר הלב האנושי הבריא והחולה במבחנה תוך שחזור היבטים מרכזיים של נישת הלב הטבעית. כתב יד זה מתאר פרוטוקול לייצור וניתוח רקמות לב מהונדסות בעלות תוכן גבוה שנוצרו מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם.
אי ספיקת לב נותרה סיבת המוות המובילה ברחבי העולם, מה שיוצר צורך דחוף במודלים פרה-קליניים טובים יותר של הלב האנושי. הנדסת רקמות חיונית למחקר לב מדעי בסיסי; תרבית תאים אנושית במבחנה מבטלת את ההבדלים בין המינים של מודלים של בעלי חיים, בעוד שסביבה תלת-ממדית דמוית רקמה יותר (למשל, עם מטריצה חוץ-תאית וצימוד הטרו-תאי) מדמה תנאי in vivo במידה רבה יותר מאשר תרבית דו-ממדית מסורתית על צלחות פטרי מפלסטיק. עם זאת, כל מערכת מודל דורשת ציוד מיוחד, למשל, ביוריאקטורים שתוכננו בהתאמה אישית והתקני הערכה פונקציונליים. בנוסף, פרוטוקולים אלה הם לעתים קרובות מסובכים, עתירי עבודה, ונגועים בכשל של רקמות קטנות ועדינות.
מאמר זה מתאר תהליך ליצירת מערכת מודל חזקה של רקמת לב מהונדסת אנושית (hECT) באמצעות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע לצורך מדידה אורכית של תפקוד הרקמות. שישה hECTs עם גיאומטריית רצועה ליניארית מתורבתים במקביל, כאשר כל hECT תלוי מזוג עמודי פולידימתילסילוקסאן (PDMS) חישת כוח המחוברים לארונות תקשורת PDMS. כל פוסט מכוסה במעקב פוסט יציב PDMS שחור (SPoT), תכונה חדשה המשפרת את קלות השימוש, התפוקה, שימור הרקמות ואיכות הנתונים. הצורה מאפשרת מעקב אופטי אמין אחר סטיות פוסט, ומניבה עקבות כוח עווית משופרות עם מתח אקטיבי ופסיבי מוחלט. גיאומטריית המכסה מבטלת כשל רקמות עקב hECTs המחליקים מהעמודים, ומכיוון שהם כרוכים בשלב שני לאחר ייצור ארון תקשורת PDMS, ניתן להוסיף את ה- SPoTs לתכנונים קיימים מבוססי PDMS לאחר ללא שינויים משמעותיים בתהליך ייצור הביוריאקטורים.
המערכת משמשת להדגמת החשיבות של מדידת תפקוד hECT בטמפרטורות פיזיולוגיות ומראה תפקוד רקמה יציב במהלך איסוף נתונים. לסיכום, אנו מתארים מערכת מודל חדישה המשחזרת מצבים פיזיולוגיים מרכזיים כדי לקדם את הנאמנות הביולוגית, היעילות והקפדנות של רקמות לב מהונדסות ליישומי מבחנה .
מודלים הנדסיים של רקמת לב מגיעים במגוון רחב של גיאומטריות ותצורות לסיכום היבטים שונים של נישת הלב הטבעית שקשה להשיג עם תרבית תאים דו-ממדית מסורתית. אחת התצורות הנפוצות ביותר היא רצועת הרקמה הליניארית, עם עוגנים גמישים בכל קצה כדי לגרום להרכבה עצמית של הרקמה ולספק לרקמה עומס מקדים מוגדר וקריאה של כוחות העווית המתקבלים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. ניתן לקבוע את הכוח שנוצר באמצעות מעקב אופטי אחר קיצור הרקמה ושימוש בתורת הקרן האלסטית כדי לחשב את הכוח מהסטיות הנמדדות וקבוע הקפיץ של העוגנים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
עם זאת, הנדסת רקמות לב היא עדיין תחום מתפתח, וכמה אתגרים נותרו. ציוד מיוחד, כגון ביוריאקטורים בהתאמה אישית והתקני הערכה פונקציונליים, נדרשים עבור כל מערכת דגם 10,29,30,31. הגודל והמורכבות של המיקרו-סביבה של מבנים אלה מוגבלים לעתים קרובות על ידי תפוקה נמוכה עקב פרוטוקולים עתירי עבודה, מספר גבוה של תאים ושבריריות רקמות. כדי להתמודד עם זה, כמה קבוצות פנו לייצור של מיקרו-רקמות המכילות רק מאות או אלפי תאים כדי להקל על בדיקות תפוקה גבוהה כי הם שימושיים לגילוי תרופות. עם זאת, קנה מידה מופחת זה מסבך את ההערכה המדויקת של תפקוד12, מבטל היבטים מרכזיים של נישה לבבית טבעית (כגון שיפועים של דיפוזיה של חומרים מזינים / חמצן וארכיטקטורה מורכבת36), ומגביל את כמות החומר הזמין לניתוח מולקולרי ומבני לאחר מכן (לעתים קרובות דורש איגום של הרקמות). טבלה 1 מסכמת חלק מהתצורות של מודלים של רצועות רקמה ליניאריות בספרות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
קבוצה | תאים לרקמה | רקמות לצלחת | פורמט צלחת | תכונת עיגון | שיטת רכישת נתונים פונקציונלית | אמבט מדיה משותף? | מדד פונקציונלי- מנט באתרו? |
||||
יושידה (ECT)38 | 4 מיליון | 6 | צלחת שונה עם 6 בארות* | מתמר כוח | מדידת כוח ישיר | לא | לא | ||||
צ’אן (hESC-CM-ECTs)26 | 310 אלף | 6 | מנה מותאמת אישית של 6 בארות | הודעות PDMS | מדידת כוח ישיר | כן | לא | ||||
פיינברג (DYN-EHT)16 | 1.5 מיליון | 6 | מנה מותאמת אישית של 6 בארות | חוט PDMS | צורת רקמה | לא | כן | ||||
רדיסי (BioWire)39, 40 | 110 אלף | 8 | חוט פולימרי | צורת חוט | כן | כן | |||||
קוסטה (hECT)1, 2 | 1-2 מיליון | 4** | צלחת פטרי בקוטר 10 ס”מ** | הודעות PDMS | סטייה אופטית (מעקב אחר קצוות/אובייקטים) | כן | כן | ||||
קוסטה (multi-hECT)3–9 | 500 K-1 מיליון | 6 | צלחת פטרי בקוטר 6 ס”מ | הודעות PDMS | סטייה אופטית (מעקב אחר קצוות/אובייקטים) | כן | כן | ||||
קוסטה (multi-hECT עם SPoT) | 1 מיליון | 6 | צלחת פטרי בקוטר 6 ס”מ | פוסטים PDMS עם אותיות גדולות בשחור | סטייה אופטית (מעקב אחר אובייקטים) | כן | כן | ||||
פסייר (EHT)17 | 245 אלף | 36 | צלחת 12 בארות | פוסטים PDMS עם אותיות גדולות בשחור | סטייה אופטית (מעקב אחר אובייקטים) | כן | כן | ||||
וונג’אק-נובקוביץ’13, 18 | 1 מיליון | 12 | צלחת פטרי בקוטר 6 ס”מ | הודעות PDMS עם מכסות | סטייה אופטית (זיהוי שוליים) | כן | כן | ||||
ווניאק-נובקוביץ’ (מיליפילאר)14 | 550 אלף | 6 | מנה מותאמת אישית של 6 בארות | הודעות PDMS עם מכסות | סטייה אופטית (מעקב אחר אובייקטים); הדמיית סידן | לא | כן | ||||
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 | 1 מיליון | 12 | צלחת 12 בארות | הודעות PDMS עם מכסות | סטייה אופטית (זיהוי קצה של סטייה לאחר מכן); הדמיית סידן | לא | כן | ||||
זנדסטרה (קמירי)22 | 25-150 אלף | 96 | צלחת 96 באר | הודעות PDMS עם ווים | סטייה אופטית (זיהוי שוליים) | לא | כן | ||||
מורי23, 24 | 900 אלף | 24 | צלחת 24 בארות | עמודי PDMS עם מכסים, מגנט משולב | חיישן מגנטי | לא | כן | ||||
רייך (μTUG)11, 12, 25 | מוגדר | 156 | מנה של 156 בארות | עמודי PDMS עם מכסים, מגנט משולב | מעקב אופטי (חרוז פלואורסצנטי) | כן | כן |
טבלה 1: מאפיינים של כמה מודלים ליניאריים של רקמת לב מהונדסת בספרות. מודלים ליניאריים של רקמת לב מהונדסים משתנים בגודל, בתפוקה, בעיצובי תכונות העיגון ובהקלה על אמבטיות בינוניות משותפות, כמו גם בדרישות למערכת אמבט שרירים נפרדת לאפיון פונקציונלי. * החוקרים השתמשו במערכת רקמות מהונדסת זמינה מסחרית המבוססת על הממדים של צלחת סטנדרטית בעלת 6 בארות. ** מערכת מודולרית שבה ביוריאקטורים של רקמה בודדת מעוגנים לכל צלחת תרבית פלסטיק במספר ובמיקום הרצויים.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול העדכני ביותר לייצור המודל המבוסס שלנו של רקמת לב מהונדסת אנושית ליניארית (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 ושיטות להערכת תפקוד התכווצות hECT. כל ביוריאקטור רב-רקמתי מכיל עד שישה hECTs באמבטיה בינונית משותפת ומורכב משתי חתיכות “מתלה” העשויות מאלסטומר סיליקון פולידימתילסילוקסאן (PDMS) המורכב על מסגרת פוליסולפון קשיחה. כל ארון תקשורת PDMS מכיל שישה עמודי חישת כוח משולבים גמישים בקוטר 0.5 מ”מ ובאורך 3.25 מ”מ, ויחד, שני ארונות תקשורת מספקים שישה זוגות עמודים, שכל אחד מהם מכיל hECT אחד. היפוך הביוריאקטור מסייע להתגבר על כל מכשול להדמיה של hECTs מלמטה עקב עיבוי מים ממדיום התרבית או עיוותים מהמניסקוס של ממשק אוויר-נוזל. כל התכווצות של hECT גורמת להטיה של עמדות הקצה המשולבות, והמדידה האופטית של אות הסטייה מעובדת למעקב כוח לעומת זמן המייצג את פונקציית ההתכווצות של hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . בהשוואה לביוריאקטורים של רקמה בודדת המשמשים בדרך כלל לרקמות בגודל זה, התכנון הרב-רקמתי משפר את תפוקת הניסוי ומאפשר לחקור איתות פרקריני בין רקמות סמוכות בעלות הרכב תאי שונה. מערכת זו אומתה במחקרים שפורסמו המתארים יישומים במידול מחלות 4,8, איתות פרקריני 6,7, תרבית הטרו-תאית 5,9 וסינון טיפולי 7,9.
במערכת זו, hECTs מתוכננים להיות באורך של כ -6 מ”מ וקוטר של 0.5 מ”מ כדי להקל על מעקב אופטי חזק של מדידות כוח עם רעש נמוך. יתר על כן, היבטים של מורכבות הרקמה כגון שיפועי דיפוזיה וארגון תאי מאוזנים עם דרישה ניתנת לניהול של 1 מיליון תאים לכל רקמה. עם טכנולוגיית מצלמת CCD סטנדרטית, כוחות חלשים כמו 1 μN (המייצגים פחות מ -5 מיקרומטר לאחר הסטיה) מייצרים אות ברור, ומבטיחים כי אפילו תפקוד כיווץ חלש מאוד, כפי שנצפה עם כמה מודלים של מחלת hECT, ניתן למדוד במדויק. זה גם מקל על ניתוח מפורט של עקומת כוח העווית, ובכך מאפשר ניתוח תוכן גבוה של עד 16 מדדי התכווצות41, כולל כוח מפותח, שיעורי התכווצות (+dF / dt) והרפיה (−dF / dt), והשתנות קצב פעימה.
פרוטוקול זה מתחיל בהוראות לייצור רכיבי הביוריאקטורים. תשומת לב מיוחדת מוקדשת לצעדים כדי למקסם את תפוקת hECT, להפחית את השונות הטכנית בתפקוד הרקמה, ולייעל את האיכות והעומק של הערכת הרקמות. רוב מחקרי הנדסת רקמות הלב אינם מדווחים על שיעורי אובדן רקמות במהלך ייצור ובדיקות ארוכות טווח, אם כי זהו אתגר ידוע בתחום ומפחית את התפוקה והיעילות של המחקרים27. שיטות הנדסת הרקמות המתוארות כאן שוכללו במהלך השנים כדי להבטיח שמירה על כל hECTs ברוב הביוריאקטורים (ללא קשר לאופן הייצור של ארונות PDMS). עם זאת, אפילו אובדן של 5%-20% של רקמות יכול להשפיע באופן משמעותי על הכוח הסטטיסטי, במיוחד בניסויים קטנים יותר המוגבלים על ידי מספר הקרדיומיוציטים הזמינים (למשל, בשל אתגרי התמיינות עם כמה קווי תאים חולים4 או בשל העלות הגבוהה של קרדיומיוציטים שנרכשו באופן מסחרי), או על ידי מצב הטיפול (למשל, זמינות מוגבלת או עלות גבוהה של תרכובות טיפול שונות).
פרוטוקול זה מתאר ייצור של עוקבי פוסט יציבים (SPoTs), תכונה חדשה של ארונות תקשורת PDMS, המתפקדים כמכסים בקצות עמדות חישת הכוח המחזיקות את hECTs27. הוא מדגים כיצד גיאומטריית הכובע מפחיתה באופן משמעותי את אובדן hECT מנפילה או משיכת העמודים, ובכך פותחת הזדמנויות חדשות לטיפוח hECTs עם מגוון גדול יותר של נוקשות ומתחים, אשר מאתגרים את התרבות על עמודים לא מכוסים . בנוסף, ה- SPoTs מספק אובייקט בעל ניגודיות גבוהה לשיפור המעקב האופטי אחר התכווצות hECT באמצעות צורה עקבית ומוגדרת היטב27. לאחר מכן מופיע תיאור של גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) והתמיינות קרדיומיוציטים בהתבסס על פרוטוקולים 3,42,43 שפורסמו בעבר והסבר על ייצור hECT, תרבית ומדידות תפקודיות.
מאמר זה מתייחס גם לצורך למדוד את תפקוד הרקמה בטמפרטורה פיזיולוגית. שריר הלב האנושי (רקמות בריאות וחולות עובריות כמו גם בוגרות), כמו גם רקמת לב ממגוון רחב של מיני בעלי חיים (כולל חולדות, חתולים, עכברים, חמוסים וארנבות)44,45, מציג עלייה ניכרת בכוח העווית התואם לתדר בטמפרטורות של 28 ° C – 32 ° C בהשוואה לטמפרטורה פיזיולוגית – תופעה המכונה אינוטרופיה היפותרמית45, 46. עם זאת, ההשפעות של הטמפרטורה על תפקוד רקמת שריר הלב המהונדסת עדיין לא נחקרו. מודלים רבים של רקמת לב מהונדסים לאחרונה בספרות מתוכננים להיות מוערכים תפקודית ב 37 ° C כדי להעריך תנאים פיזיולוגיים מקורבים 13,14,37. עם זאת, למיטב ידיעתנו, ההשפעות תלויות הטמפרטורה על הכוח שנוצר על ידי רקמות לב מהונדסות, לא נחקרו באופן שיטתי. פרוטוקול זה מתאר תכנון אלקטרודות קצב הממזער את איבוד החום במהלך הבדיקה, וכן מאפשר שילוב של גוף חימום מבודד במערך למדידות פונקציונליות, אשר יכול לשמור על hECTs בטמפרטורה פיזיולוגית מבלי להתפשר על סטריליות27. לאחר מכן אנו מדווחים על חלק מההשפעות הנצפות של הטמפרטורה על תפקוד hECT, כולל על הכוח המפותח, תדירות המכות הספונטניות, +dF/dt ו- −dF/dt. בסך הכל, מאמר זה מספק את הפרטים הדרושים לייצור מערכת ביוריאקטור רב-רקמתית זו לחישת כוח כדי לייצר רקמות לב מהונדסות-אנושיות ולהעריך את תפקוד ההתכווצות שלהן, ומוצגת קבוצה של נתונים המספקת בסיס להשוואה למדידות בטמפרטורת החדר וב-37°C27.
ישנם מודלים רבים של רקמת לב מהונדסת ליניארית שפורסמו בספרות, חלקם מתוארים בטבלה 1. מודלים מסוימים כוללים מדידה ישירה של כוח הרקמה, אך אלה בדרך כלל דורשים העברת המבנה לאמבט שרירים נפרד38. רוב הדגמים מתוכננים כאשר הרקמות מעוגנות באופן קבוע בשני הקצוות, לרוב לעמדות PDMS<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לד”ר טימותי קשמן על עבודתו הקודמת בשיטה זו. מחקר זה נתמך על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01-HL132226 ו- K01 HL133424) ותוכנית רשתות מצוינות בינלאומיות של קרן לדוק (CURE-PLaN).
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |