줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.
심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있어 인간 심장에 대한 더 나은 전임상 모델이 절실히 필요합니다. 조직 공학은 기초 과학 심장 연구에 매우 중요합니다. 체외 인간 세포 배양은 동물 모델의 종간 차이를 제거하는 반면, 조직과 유사한 3D 환경(예: 세포외 기질 및 이세포 결합)은 플라스틱 페트리 접시에 대한 기존의 2차원 배양보다 생체 내 조건을 더 많이 시뮬레이션합니다. 그러나 각 모델 시스템에는 맞춤형 바이오리액터 및 기능 평가 장치와 같은 특수 장비가 필요합니다. 또한 이러한 프로토콜은 종종 복잡하고 노동 집약적이며 작고 섬세한 조직의 결함으로 인해 어려움을 겪습니다.
이 논문은 조직 기능의 종단 측정을 위해 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 강력한 인간 공학 심장 조직(hECT) 모델 시스템을 생성하는 프로세스를 설명합니다. 선형 스트립 형상을 가진 6개의 hECT를 병렬로 배양하며, 각 hECT는 PDMS 랙에 부착된 한 쌍의 힘 감지 폴리디메틸실록산(PDMS) 포스트에 매달려 있습니다. 각 게시물은 사용 편의성, 처리량, 조직 보존 및 데이터 품질을 개선하는 새로운 기능인 검은색 PDMS SPoT(Stable Post Tracker)로 제한됩니다. 이 모양은 포스트 편향의 신뢰할 수 있는 광학 추적을 가능하게 하여 절대적인 능동 및 수동 장력으로 향상된 트위치 힘 추적을 제공합니다. 캡 형상은 포스트에서 미끄러지는 hECT로 인한 조직 손상을 제거하고, PDMS 랙 제조 후 두 번째 단계를 포함하므로 바이오리액터 제조 공정을 크게 변경하지 않고도 SPoT를 기존 PDMS 포스트 기반 설계에 추가할 수 있습니다.
이 시스템은 생리학적 온도에서 hECT 기능 측정의 중요성을 입증하는 데 사용되며 데이터 수집 중에 안정적인 조직 기능을 보여줍니다. 요약하면, 우리는 체외 응용을 위해 조작된 심장 조직의 생체 충실도, 효율성 및 엄격성을 발전시키기 위해 주요 생리학적 조건을 재현하는 최첨단 모델 시스템을 설명합니다.
엔지니어링된 심장 조직 모델은 기존의 2차원 세포 배양으로는 달성하기 어려운 천연 심장 틈새의 다양한 측면을 재현하기 위해 다양한 형상과 구성으로 제공됩니다. 가장 일반적인 구성 중 하나는 선형 조직 스트립으로, 각 끝에 유연한 앵커가 있어 조직 자가 조립을 유도하고 조직에 정의된 예압과 결과 경련력 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27입니다. 생성된 힘은 조직 단축의 광학적 추적 및 탄성 빔 이론을 사용하여 앵커(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11)의 측정된 편향 및 스프링 상수로부터 힘을 계산함으로써 견고하게 측정될 수 있습니다. 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28입니다.
그러나 심장 조직 공학은 여전히 진화하는 분야이며 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 맞춤형 생물반응기 및 기능 평가 장치와 같은 특수 장비가 각 모델 시스템(10,29,30,31)에 필요합니다. 이러한 구성물의 미세환경의 크기와 복잡성은 노동 집약적인 프로토콜, 많은 수의 세포 및 조직 취약성으로 인한 낮은 처리량으로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 이 문제를 해결하기 위해 일부 그룹은 약물 발견에 유용한 고처리량 분석을 용이하게 하기 위해 수백 또는 수천 개의 세포만 포함하는 미세 조직 제조로 전환했습니다. 그러나, 이러한 축소된 규모는 기능(12)의 정확한 평가를 복잡하게 하고, 본래 심장 틈새의 주요 측면(예: 영양소/산소 확산 구배 및 복잡한 구조(36))을 제거하며, 후속 분자 및 구조 분석에 사용할 수 있는 물질의 양을 제한한다(종종 조직의 풀링이 필요함). 표 1은 문헌 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15에 있는 선형 조직 스트립 모델의 일부 구성을 요약 한 것이다. 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40입니다.
그룹 | 조직당 세포 수 | 접시당 조직 | 플레이트 형식 | 앵커링 기능 | 기능적 데이터 수집 방법 | 공유 미디어 목욕? | 기능적 측정- 멘트 in situ? |
||||
요시다 (ECT)38 | 400만 | 6 | 수정된 6웰 플레이트* | 힘 변환기 | 직접 힘 측정 | 아니요 | 아니요 | ||||
챈 (hESC-CM-ECT)26 | 310의 케이 | 6 | 맞춤형 6웰 접시 | PDMS 게시물 | 직접 힘 측정 | 예 | 아니요 | ||||
파인버그(dyn-EHT)16 | 150만 | 6 | 맞춤형 6웰 접시 | PDMS 와이어 | 조직 형태 | 아니요 | 예 | ||||
RADISIC(바이오와이어)39, 40 | 110 케이 | 8 | 폴리머 와이어 | 와이어 형상 | 예 | 예 | |||||
Costa(단일 HECT)1, 2 | 1-200만 | 4** | 10cm 페트리 접시** | PDMS 게시물 | 광학 편향(에지/물체 추적) | 예 | 예 | ||||
Costa (multi-hECT)3–9 | 500 K-100만 | 6 | 6cm 페트리 접시 | PDMS 게시물 | 광학 편향(에지/물체 추적) | 예 | 예 | ||||
Costa(다중 hECT W/ SPoT) | 100만 | 6 | 6cm 페트리 접시 | 검은색 대문자가 있는 PDMS 게시물 | 광학 편향(물체 추적) | 예 | 예 | ||||
파시어 (EHT)17 | 245 케이 | 36 | 12웰 플레이트 | 검은색 대문자가 있는 PDMS 게시물 | 광학 편향(물체 추적) | 예 | 예 | ||||
분작-노바코비치13, 18 | 100만 | 12 | 6cm 페트리 접시 | 캡이 있는 PDMS 포스트 | 광학 편향(가장자리 감지) | 예 | 예 | ||||
분작-노바코비치(MilliPillar)14 | 550의 케이 | 6 | 맞춤형 6웰 접시 | 캡이 있는 PDMS 포스트 | 광학 편향(물체 추적); 칼슘 이미징 | 아니요 | 예 | ||||
에셴하겐 (EHT)10, 19–21 | 100만 | 12 | 12웰 플레이트 | 캡이 있는 PDMS 포스트 | 광학 편향(포스트 편향의 가장자리 감지); 칼슘 이미징 | 아니요 | 예 | ||||
잔드스트라 (카미리)22 | 25-150 케이 | 96 | 96웰 플레이트 | 후크가 있는 PDMS 게시물 | 광학 편향(가장자리 감지) | 아니요 | 예 | ||||
머리23, 24 | 900 케이 | 24 | 24웰 플레이트 | 캡이 있는 PDMS 포스트, 통합 자석 | 마그네틱 센서 | 아니요 | 예 | ||||
라이히 (μTUG)11, 12, 25 | 정의 | 156 | 156웰디쉬 | 캡이 있는 PDMS 포스트, 통합 자석 | 광학 추적(형광 비드) | 예 | 예 |
표 1: 문헌에 있는 일부 선형 공학 심장 조직 모델의 특성. 선형 엔지니어링 심장 조직 모델은 크기, 처리량, 고정 기능 설계, 공유 배지 수조의 용이성뿐만 아니라 기능적 특성화를 위한 별도의 근육 수조 시스템에 대한 요구 사항이 다양합니다. * 연구원들은 표준 6웰 플레이트의 치수를 기반으로 상업적으로 이용 가능한 엔지니어링 조직 시스템을 사용했습니다. ** 단일 조직 바이오리액터가 원하는 수와 위치의 모든 플라스틱 배양 접시에 고정되는 모듈식 시스템.
이 논문은 선형 인간 공학 심장 조직(hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27의 확립된 모델을 제작하기 위한 최신 프로토콜을 설명합니다 및 hECT 수축 기능을 평가하는 방법. 각 다중 조직 바이오리액터는 공유 배지 수조에 최대 6개의 hECT를 수용할 수 있으며 견고한 폴리설폰 프레임에 장착된 실리콘 엘라스토머 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만들어진 2개의 “랙” 부품으로 구성됩니다. 각 PDMS 랙에는 직경 0.5mm, 길이 3.25mm의 유연한 통합 힘 감지 포스트 6개가 포함되어 있으며, 2개의 랙은 각각 1개의 hECT를 수용하는 6쌍의 포스트를 제공합니다. 바이오리액터의 반전은 배양 배지의 수분 응축 또는 공기-액체 계면의 반월상 연골로 인한 왜곡으로 인해 아래에서 hECT를 시각화하는 데 방해가 되는 것을 극복하는 데 도움이 됩니다. hECT의 각 수축은 통합 단부 포스트의 편향을 유발하고, 편향 신호의 광학 측정은 hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27의 수축 함수를 나타내는 힘 대 시간 추적으로 처리됩니다 . 이 크기의 조직에 일반적으로 사용되는 단일 조직 바이오리액터와 비교했을 때, 다중 조직 설계는 실험 처리량을 개선하고 잠재적으로 다른 세포 조성의 인접 조직 간의 파라크린 신호 연구를 가능하게 합니다. 이 시스템은 질병 모델링 4,8, 파라크린 신호 전달 6,7, 이세포 배양 5,9 및 치료 스크리닝 7,9의 응용 분야를 설명하는 발표된 연구에서 검증되었습니다.
이 시스템에서 hECT는 길이 약 6mm, 직경 0.5mm로 설계되어 노이즈가 적은 힘 측정에 대한 강력한 광학 추적을 용이하게 합니다. 또한 확산 구배 및 세포 조직과 같은 조직 복잡성의 측면은 조직당 100만 개의 세포라는 관리 가능한 요구 사항과 균형을 이룹니다. 표준 CCD 카메라 기술을 사용하면 1μN의 약한 힘(편향 후 5μm 미만을 나타냄)이 명확한 신호를 생성하여 일부 hECT 질병 모델에서 관찰되는 것처럼 극도로 약한 수축 기능도 정확하게 측정할 수 있습니다. 이것은 또한 경련력 곡선의 상세한 분석을 용이하게 하여, 발달된 힘, 수축률(+dF/dt) 및 이완률(-dF/dt) 및 박동 변동성을 포함한 최대 16개의 수축성 지표(41)에 대한 고함량 분석을 가능하게 한다.
이 프로토콜은 생물반응기 구성 요소를 제조하기 위한 지침으로 시작합니다. hECT 수율을 극대화하고, 조직 기능의 기술적 변동성을 줄이며, 조직 평가의 품질과 깊이를 최적화하기 위한 단계에 특별한 주의를 기울입니다. 대부분의 심장 조직 공학 연구는 제조 및 장기 테스트 중 조직 손실률을 보고하지 않지만, 이는 현장에서 잘 알려진 과제이며 연구의 처리량과 효율성을 감소시킨다27. 여기에 설명된 조직 공학 방법은 대부분의 바이오리액터에서 모든 hECT의 머무름을 보장하기 위해 수년에 걸쳐 개선되었습니다(PDMS 랙 제조 방법에 관계없이). 그러나, 5%-20%의 조직 손실조차도 통계적 검증력에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 특히 이용 가능한 심근세포의 수(예: 일부 병든세포주4 의 분화 문제 또는 상업적으로 구매된 심근세포의 높은 비용으로 인해) 또는 치료 조건(예: 다양한 처리 화합물의 제한된 가용성 또는 높은 비용)에 의해 제한되는 소규모 실험에서 유의하게 영향을 미칠 수 있습니다.
이 프로토콜은 hECTs(27)를 고정하는 힘-감지 포스트의 끝에서 캡 역할을 하는 PDMS 랙의 새로운 기능인 SPoT(Stable Post Tracker)의 제작을 설명한다. 캡 형상이 포스트에서 떨어지거나 당겨질 때 발생하는 hECT 손실을 크게 줄여 캡이 없는 포스트에서 배양하기 어려운 다양한 강성과 장력을 가진 hECT를 배양할 수 있는 새로운 기회를 열어주는 방법을 보여줍니다. 또한, SPoT는 일관되고 잘 정의된 형상(27)을 통해 hECT 수축의 광학적 추적을 개선하기 위해 고대비 물체를 제공한다. 그 다음에는 이전에 발표된 프로토콜 3,42,43에 기반한 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 배양 및 심근세포 분화에 대한 설명과 hECT 제조, 배양 및 기능 측정에 대한 설명이 이어집니다.
이 기사에서는 생리학적 온도에서 조직 기능을 측정해야 할 필요성에 대해서도 다룹니다. 인간 심근(태아 및 성인 건강 및 질병 조직)과 다양한 동물 종(쥐, 고양이, 생쥐, 페럿 및 토끼 포함)의 심장 조직(44,45)은 생리적 온도에 비해 28°C-32°C의 온도에서 주파수 일치 경련력의 현저한 증가를 나타내며, 이는 저체온성 수축으로 알려진 현상입니다45, 46. 그러나 조작된 심근 조직 기능에 대한 온도의 영향은 아직 연구가 부족합니다. 문헌에 있는 많은 최근의 공학적 심장 조직 모델은 생리학적 조건을 근사화하기 위해 37°C에서 기능적으로 평가되도록 설계되었다 13,14,37. 그러나 우리가 아는 한, 조작된 심장 조직에 의해 생성된 힘에 대한 온도에 따른 영향은 체계적으로 조사되지 않았습니다. 이 프로토콜은 테스트 중 열 손실을 최소화할 뿐만 아니라 무균성을 손상시키지 않고 hECT를 생리적 온도로 유지할 수 있는 기능 측정을 위한 설정에 절연된 발열체를 통합할 수 있도록 하는 페이싱 전극 설계를 설명합니다(27). 그런 다음 발달된 힘, 자발적 박동 주파수, +dF/dt 및 -dF/dt를 포함하여 hECT 기능에 대한 온도의 관찰된 영향 중 일부를 보고합니다. 전체적으로, 이 논문은 인간이 설계한 심장 조직을 제작하고 수축 기능을 평가하기 위해 이 다중 조직 힘 감지 생물 반응기 시스템을 제조하는 데 필요한 세부 정보를 제공하며, 실온 및 37°C에서 측정을 위한 비교를 위한 기초를 제공하는 일련의 데이터를 제공합니다27.
문헌에 발표된 수많은 선형 공학 심장 조직 모델이 있으며, 그 중 일부는 표 1에 설명되어 있습니다. 일부 모델은 조직력의 직접 측정을 수반하지만, 이들은 전형적으로 작제물을 별도의 근육 욕조(38)로 이송할 것을 요구한다. 대부분의 모형은 PDMS 포스트 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16에 영구히 정박된 조직으로, 일반적으로 디자인됩니다 <su…
The authors have nothing to disclose.
저자는 이 방법에 대한 이전 연구에 대해 Timothy Cashman 박사를 인정합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)(R01-HL132226 및 K01 HL133424)과 Leducq Foundation International Networks of Excellence Program(CURE-PLaN)의 자금 지원을 받았습니다.
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |