تصميم مفاعل حيوي لتحسين الحصول على البيانات ونمذجة إنتاجية أنسجة القلب المهندسة
Summary
ظهرت أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد المهندسة بيولوجيا باستخدام خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية كنماذج واعدة لدراسة عضلة القلب البشرية السليمة والمريضة في المختبر مع تلخيص الجوانب الرئيسية لمكانة القلب الأصلية. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتصنيع وتحليل أنسجة القلب المهندسة عالية المحتوى الناتجة عن خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
Abstract
لا يزال قصور القلب السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم ، مما يخلق حاجة ملحة لنماذج أفضل قبل السريرية لقلب الإنسان. هندسة الأنسجة أمر بالغ الأهمية لأبحاث القلب العلوم الأساسية. في زراعة الخلايا البشرية في المختبر يزيل الاختلافات بين الأنواع من النماذج الحيوانية ، في حين أن بيئة 3D أكثر مثل الأنسجة (على سبيل المثال ، مع مصفوفة خارج الخلية واقتران الخلايا غير المتجانسة) يحاكي في ظروف الجسم الحي إلى حد أكبر من الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد على أطباق بتري البلاستيكية. ومع ذلك ، يتطلب كل نظام نموذجي معدات متخصصة ، على سبيل المثال ، المفاعلات الحيوية المصممة خصيصا وأجهزة التقييم الوظيفي. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون هذه البروتوكولات معقدة وكثيفة العمالة وتعاني من فشل الأنسجة الصغيرة والحساسة.
تصف هذه الورقة عملية لتوليد نظام نموذج قوي للأنسجة القلبية البشرية المهندسة (hECT) باستخدام خلايا عضلة القلب المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية للقياس الطولي لوظيفة الأنسجة. يتم استزراع ستة hECTs مع هندسة الشريط الخطي بالتوازي ، مع تعليق كل hECT من زوج من أعمدة polydimethylsiloxane (PDMS) المستشعرة للقوة المرفقة برفوف PDMS. يتم تغطية كل منشور بمتتبع منشور PDMS مستقر أسود (SPoT) ، وهي ميزة جديدة تعمل على تحسين سهولة الاستخدام والإنتاجية والاحتفاظ بالأنسجة وجودة البيانات. يسمح الشكل بالتتبع البصري الموثوق به للانحرافات اللاحقة ، مما يؤدي إلى تحسين تتبع قوة النشل مع التوتر النشط والسلبي المطلق. تعمل هندسة الغطاء على التخلص من فشل الأنسجة بسبب انزلاق hECTs من الأعمدة ، ولأنها تتضمن خطوة ثانية بعد تصنيع رف PDMS ، يمكن إضافة SPoTs إلى التصميمات الحالية القائمة على PDMS دون تغييرات كبيرة في عملية تصنيع المفاعل الحيوي.
يستخدم النظام لإثبات أهمية قياس وظيفة hECT في درجات الحرارة الفسيولوجية ويظهر وظيفة الأنسجة المستقرة أثناء الحصول على البيانات. باختصار ، وصفنا نظاما نموذجيا متطورا يعيد إنتاج الظروف الفسيولوجية الرئيسية لتعزيز الدقة الحيوية والكفاءة والدقة لأنسجة القلب المهندسة للتطبيقات في المختبر .
Introduction
تأتي نماذج أنسجة القلب المهندسة في مجموعة متنوعة من الأشكال الهندسية والتكوينات لتلخيص الجوانب المختلفة لمكانة القلب الأصلية التي يصعب تحقيقها باستخدام ثقافة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد. أحد أكثر التكوينات شيوعا هو شريط الأنسجة الخطي ، مع مثبتات مرنة في كل طرف للحث على التجميع الذاتي للأنسجة وتزويد الأنسجة بتحميل مسبق محدد وقراءة لقوى النشل الناتجة1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11 ، 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
، 22،23،24،25،26،27. يمكن تحديد القوة المتولدة بقوة من خلال التتبع البصري لتقصير الأنسجة واستخدام نظرية الحزمة المرنة لحساب القوة من الانحرافات المقاسة وثابت الزنبرك للمثبتات1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11 ، 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21،22،25،26،28.
ومع ذلك ، لا تزال هندسة أنسجة القلب مجالا متطورا ، ولا تزال هناك بعض التحديات. المعدات المتخصصة ، مثل المفاعلات الحيوية المصنوعة حسب الطلب وأجهزة التقييم الوظيفي ، مطلوبة لكل نظام نموذجي10،29،30،31. غالبا ما يكون حجم وتعقيد البيئة المكروية لهذه التركيبات محدودا بسبب انخفاض الإنتاجية بسبب البروتوكولات كثيفة العمالة ، والأعداد الكبيرة من الخلايا ، وهشاشة الأنسجة. لمعالجة هذا الأمر ، تحولت بعض المجموعات إلى تصنيع الأنسجة الدقيقة التي تحتوي فقط على مئات أو آلاف الخلايا لتسهيل المقايسات عالية الإنتاجية المفيدة لاكتشاف الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذا المقياس المخفض يعقد التقييم الدقيق للوظيفة12 ، ويزيل الجوانب الرئيسية لمكانة القلب الأصلية (مثل تدرجات انتشار المغذيات / الأكسجين والهندسة المعقدة36) ، ويحد من كمية المواد المتاحة للتحليل الجزيئي والهيكلي اللاحق (غالبا ما يتطلب تجميع الأنسجة). يلخص الجدول 1 بعض تكوينات نماذج شريط الأنسجة الخطية في الأدبيات1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، 16,17,18,19,20,
21،22،23،24،25،26،37،38،39،40.
| مجموعة | الخلايا لكل نسيج | المناديل لكل لوحة | شكل لوحة | ميزة الإرساء | طريقة الحصول على البيانات الوظيفية | حمام وسائط مشترك؟ | مقياس وظيفي- منة في الموقع؟ |
||||
| يوشيدا (إلخ)38 | 4 مليون | 6 | لوحة معدلة من 6 آبار * | محول القوة | قياس القوة المباشرة | لا | لا | ||||
| تشان (hESC-CM-ECTs)26 | 310 ألف | 6 | طبق مخصص 6 آبار | مشاركات PDMS | قياس القوة المباشرة | نعم | لا | ||||
| فاينبرغ (dyn-EHT)16 | 1.5 مليون | 6 | طبق مخصص 6 آبار | سلك PDMS | شكل الأنسجة | لا | نعم | ||||
| راديسيك (بيوواير)39, 40 | 110 ألف | 8 | سلك البوليمر | شكل سلك | نعم | نعم | |||||
| كوستا (واحد hECT) 1 ، 2 | 1-2 مليون | 4** | صحن بتري 10 سم** | مشاركات PDMS | الانحراف البصري (تتبع الحافة/الكائن) | نعم | نعم | ||||
| كوستا (متعدد العلاج بالصدمات الكهربائية)3–9 | 500 ك – 1 مليون | 6 | طبق بتري 6 سم | مشاركات PDMS | الانحراف البصري (تتبع الحافة/الكائن) | نعم | نعم | ||||
| كوستا (متعدد hECT W / SPoT) | 1 مليون | 6 | طبق بتري 6 سم | منشورات PDMS بأحرف كبيرة سوداء | الانحراف البصري (تتبع الكائن) | نعم | نعم | ||||
| باسير (EHT)17 | 245 ألف | 36 | لوحة 12 بئر | منشورات PDMS بأحرف كبيرة سوداء | الانحراف البصري (تتبع الكائن) | نعم | نعم | ||||
| فونجاك نوفاكوفيتش13 ، 18 | 1 مليون | 12 | طبق بتري 6 سم | مشاركات PDMS مع الأحرف الاستهلالية | الانحراف البصري (اكتشاف الحواف) | نعم | نعم | ||||
| فونجاك نوفاكوفيتش (ميلي بيلار)14 | 550 ألف | 6 | طبق مخصص 6 آبار | مشاركات PDMS مع الأحرف الاستهلالية | الانحراف البصري (تتبع الكائن) ؛ تصوير الكالسيوم | لا | نعم | ||||
| إيشنهاغن (EHT)10, 19–21 | 1 مليون | 12 | لوحة 12 بئر | مشاركات PDMS مع الأحرف الاستهلالية | الانحراف البصري (كشف حافة الانحراف اللاحق) ؛ تصوير الكالسيوم | لا | نعم | ||||
| زاندسترا (كاميري)22 | 25-150 ك | 96 | لوحة 96 بئر | منشورات PDMS مع خطافات | الانحراف البصري (اكتشاف الحواف) | لا | نعم | ||||
| موري23 ، 24 | 900 ألف | 24 | لوحة 24 بئر | أعمدة PDMS مع أغطية ، مغناطيس مدمج | جهاز استشعار مغناطيسي | لا | نعم | ||||
| الرايخ (μTUG) 11 ، 12 ، 25 | غير معروف | 156 | طبق 156 بئر | أعمدة PDMS مع أغطية ، مغناطيس مدمج | التتبع البصري (حبة الفلورسنت) | نعم | نعم | ||||
الجدول 1: خصائص بعض نماذج أنسجة القلب المهندسة خطيا في الأدبيات. تختلف نماذج أنسجة القلب الخطية المهندسة في الحجم والإنتاجية وتصميمات ميزات التثبيت وتسهيل الحمامات المتوسطة المشتركة ، بالإضافة إلى متطلبات نظام حمام عضلي منفصل للتوصيف الوظيفي. * استخدم الباحثون نظام أنسجة هندسيا متاحا تجاريا يعتمد على أبعاد لوحة قياسية من 6 آبار. ** نظام معياري يتم فيه تثبيت المفاعلات الحيوية أحادية الأنسجة على أي طبق استزراع بلاستيكي بالعدد والموقع المطلوبين.
تصف هذه الورقة أحدث بروتوكول لتصنيع نموذجنا الراسخ لأنسجة القلب الخطية البشرية المهندسة (hECT) 1،2،3،4،5،6،7،8،9،15،27 وطرق تقييم وظيفة انقباض hECT. يستوعب كل مفاعل حيوي متعدد الأنسجة ما يصل إلى ستة hECTs في حمام متوسط مشترك ويتكون من قطعتين “رف” مصنوعتين من بوليديميثيل سيلوكسان من المطاط الصناعي السيليكوني (PDMS) مثبت على إطار بولي سلفون صلب. يحتوي كل حامل PDMS على ستة أعمدة مرنة متكاملة لاستشعار القوة يبلغ قطرها 0.5 مم وطولها 3.25 مم ، ومعا ، يوفر رفان ستة أزواج من الدعامات ، كل منها يحمل hECT واحدا. يساعد انعكاس المفاعل الحيوي في التغلب على أي عائق أمام تصور hECTs من الأسفل بسبب تكثيف الماء من وسط الاستزراع أو التشوهات من الغضروف المفصلي لواجهة الهواء والسائل. يؤدي كل انكماش ل hECT إلى انحراف الأعمدة الطرفية المتكاملة ، ويتم معالجة القياس البصري لإشارة الانحراف إلى قوة مقابل تتبع الوقت يمثل وظيفة انقباض hECT1،2،3،4،5،6،7،8،9،15،27. بالمقارنة مع المفاعلات الحيوية أحادية الأنسجة المستخدمة عادة للأنسجة بهذا الحجم ، فإن التصميم متعدد الأنسجة يحسن الإنتاجية التجريبية ويمكن من دراسة إشارات paracrine بين الأنسجة المجاورة ذات التركيب الخلوي المختلف المحتمل. تم التحقق من صحة هذا النظام في الدراسات المنشورة التي تصف التطبيقات في نمذجة المرض 4,8 ، وإشارات paracrine 6,7 ، والثقافة غير المتجانسة 5,9 ، والفحص العلاجي 7,9.
في هذا النظام ، تم تصميم hECTs ليبلغ طولها حوالي 6 مم وقطرها 0.5 مم لتسهيل التتبع البصري القوي لقياسات القوة ذات الضوضاء المنخفضة. علاوة على ذلك ، فإن جوانب تعقيد الأنسجة مثل تدرجات الانتشار والتنظيم الخلوي متوازنة مع متطلبات يمكن التحكم فيها تبلغ 1 مليون خلية لكل نسيج. مع تقنية كاميرا CCD القياسية ، تولد قوى ضعيفة تصل إلى 1 μN (تمثل أقل من 5 ميكرومتر بعد الانحراف) إشارة واضحة ، مما يضمن أنه حتى وظيفة الانقباض الضعيفة للغاية ، كما لوحظ مع بعض نماذج مرض hECT ، يمكن قياسها بدقة. يسهل هذا أيضا التحليل التفصيلي لمنحنى قوة النشل ، مما يتيح تحليل المحتوى العالي لما يصل إلى 16 مقياسا للانقباض41 ، بما في ذلك القوة المتقدمة ومعدلات الانكماش (+ dF / dt) والاسترخاء (−dF / dt) ، وتقلب معدل الفوز.
يبدأ هذا البروتوكول بتعليمات لتصنيع مكونات المفاعل الحيوي. يتم إيلاء اهتمام خاص للخطوات اللازمة لزيادة إنتاجية hECT ، وتقليل التباين التقني في وظيفة الأنسجة ، وتحسين جودة وعمق تقييم الأنسجة. لا تبلغ معظم دراسات هندسة أنسجة القلب عن معدلات فقدان الأنسجة أثناء التصنيع والاختبار طويل المدى ، على الرغم من أنه يمثل تحديا معروفا في هذا المجال ويقلل من إنتاجية وكفاءة الدراسات27. تم تحسين طرق هندسة الأنسجة الموصوفة هنا على مر السنين لضمان الاحتفاظ بجميع hECTs في معظم المفاعلات الحيوية (بغض النظر عن كيفية تصنيع رفوف PDMS). ومع ذلك ، حتى فقدان الأنسجة بنسبة 5٪ -20٪ يمكن أن يؤثر بشكل كبير على القوة الإحصائية ، لا سيما في التجارب الأصغر التي تقتصر على عدد خلايا عضلة القلب المتاحة (على سبيل المثال ، بسبب تحديات التمايز مع بعض خطوط الخلايا المريضة4 أو بسبب التكلفة العالية لخلايا عضلة القلب المشتراة تجاريا) ، أو حسب حالة العلاج (على سبيل المثال ، التوافر المحدود أو التكلفة العالية لمركبات العلاج المختلفة).
يصف هذا البروتوكول تصنيع أجهزة تتبع البريد المستقرة (SPoTs) ، وهي ميزة جديدة لرفوف PDMS ، والتي تعمل كأغطية في نهايات أعمدة استشعار القوة التي تحمل hECTs27. يوضح كيف تقلل هندسة الغطاء بشكل كبير من خسارة hECT من السقوط أو سحب الأعمدة ، مما يفتح فرصا جديدة لزراعة hECTs مع مجموعة أكبر من الصلابة والتوترات ، والتي تشكل تحديا للثقافة على المشاركات غير المغطاة. بالإضافة إلى ذلك ، توفر SPoTs كائنا عالي التباين لتحسين التتبع البصري لانكماش hECT من خلال شكل متسق ومحدد جيدا27. يتبع ذلك وصف لزراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) وتمايز خلايا عضلة القلب بناء على البروتوكولات المنشورة مسبقا3،42،43 وشرح لتصنيع hECT والثقافة والقياسات الوظيفية.
تتناول هذه المقالة أيضا الحاجة إلى قياس وظيفة الأنسجة في درجة الحرارة الفسيولوجية. عضلة القلب البشرية (أنسجة الجنين وكذلك الأنسجة السليمة والمريضة للبالغين) ، وكذلك أنسجة القلب من مجموعة واسعة من الأنواع الحيوانية (بما في ذلك الجرذان والقطط والفئران والقوارض والأرانب)44,45 ، تظهر زيادة ملحوظة في قوة الارتعاش المتطابقة مع التردد عند درجات حرارة 28 °C -32 °C مقارنة بدرجة الحرارة الفسيولوجية – وهي ظاهرة تعرف باسم التقلص العضلي منخفض الحرارة45 ، 46. ومع ذلك ، فإن آثار درجة الحرارة على وظيفة أنسجة عضلة القلب المهندسة لا تزال غير مدروسة. تم تصميم العديد من نماذج أنسجة القلب المهندسة حديثا في الأدبيات ليتم تقييمها وظيفيا عند 37 درجة مئوية لتقريب الظروف الفسيولوجية13،14،37. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم يتم التحقيق بشكل منهجي في التأثيرات المعتمدة على درجة الحرارة على القوة الناتجة عن أنسجة القلب المهندسة. يصف هذا البروتوكول تصميم قطب كهربائي سريع يقلل من فقد الحرارة أثناء الاختبار ، بالإضافة إلى السماح بدمج عنصر تسخين معزول في الإعداد للقياسات الوظيفية ، والتي يمكن أن تحافظ على hECTs في درجة حرارة فسيولوجية دون المساس بالعقم27. ثم نبلغ عن بعض التأثيرات الملحوظة لدرجة الحرارة على وظيفة hECT ، بما في ذلك القوة المتقدمة ، وتردد الضرب التلقائي ، + dF / dt ، و −dF / dt. إجمالا ، توفر هذه الورقة التفاصيل المطلوبة لتصنيع نظام المفاعل الحيوي متعدد الأنسجة لاستشعار القوة لتصنيع أنسجة القلب المهندسة بشريا وتقييم وظيفتها الانقباضية ، ويتم تقديم مجموعة من البيانات التي توفر أساسا للمقارنة للقياسات في درجة حرارة الغرفة وعند 37 درجة مئوية27.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من نماذج أنسجة القلب المهندسة خطيا المنشورة في الأدبيات ، وبعضها موصوف في الجدول 1. تتضمن بعض النماذج القياس المباشر لقوة الأنسجة ، ولكن هذه تتطلب عادة نقل البنية إلى حمام عضلي منفصل38. تم تصميم معظم النماذج مع الأنسجة المثبتة بشكل دائم في كلا الطرفين ، وال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالدكتور تيموثي كاشمان لعمله السابق على هذه الطريقة. تم دعم هذه الدراسة بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01-HL132226 و K01 HL133424) وبرنامج شبكات التميز الدولية لمؤسسة Leducq (CURE-PLaN).
Materials
| 0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
| 10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
| 10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
| 20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
| 5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
| 6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| 6-Well Plates | Corning | 353046 | |
| 90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
| Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
| Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
| Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
| A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
| Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
| B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
| Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
| Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
| CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
| Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
| EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
| EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
| Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
| Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
| High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
| Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
| IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
| LabView Software | National Instruments | 2016 | |
| Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
| Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
| Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
| Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
| Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
| Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
| Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
| Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
| Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
| Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
| PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
| Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
| Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
| Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
| Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
| Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
| Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
| Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
| Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
| Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
| Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
| Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
| Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
| Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
| Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
| Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
| Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
| Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
| Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |
Referências
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB Journal. 28 (2), 644-654 (2014).
- Cashman, T. J., et al. Construction of defined human engineered cardiac tissues to study mechanisms of cardiac cell therapy. Journal of Visualized Experiments. (109), e53447 (2016).
- Stillitano, F., et al. Genomic correction of familial cardiomyopathy in human engineered cardiac tissues. European Heart Journal. 37 (43), 3282-3284 (2016).
- Mayourian, J., et al. Experimental and computational insight into human mesenchymal stem cell paracrine signaling and heterocellular coupling effects on cardiac contractility and arrhythmogenicity. Circulation Research. 121 (4), 411-423 (2017).
- Mayourian, J., et al. therapeutic paracrine modulation of cardiac excitation-contraction coupling. Circulation Research. 122 (1), 167-183 (2018).
- Mayourian, J., et al. Exosomal microRNA-21-5p mediates mesenchymal stem cell paracrine effects on human cardiac tissue contractility. Circulation Research. 7 (122), 933-944 (2018).
- Turnbull, I. C., et al. Cardiac tissue engineering models of inherited and acquired cardiomyopathies. Methods in Molecular Biology. 1816, 145-159 (2018).
- Murphy, J. F., et al. Adult human cardiac stem cell supplementation effectively increases contractile function and maturation in human engineered cardiac tissues. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 373 (2019).
- Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human engineered heart tissue. Nature Protocols. 12 (6), 1177-1197 (2017).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ramade, A., Legant, W. R., Picart, C., Chen, C. S., Boudou, T. Microfabrication of a platform to measure and manipulate the mechanics of engineered microtissues. Methods in Cell Biology. 121, 191-211 (2014).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Engineering of human cardiac muscle electromechanically matured to an adult-like phenotype. Nature Protocols. 14 (10), 2781-2817 (2019).
- Tamargo, M. A., et al. milliPillar: A platform for the generation and real-time assessment of human engineered cardiac tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (11), 5215-5229 (2021).
- Ceholski, D. K., et al. CXCR4 and CXCR7 play distinct roles in cardiac lineage specification and pharmacologic β-adrenergic response. Stem Cell Research. 23, 77-86 (2017).
- Bliley, J. M., et al. Dynamic loading of human engineered heart tissue enhances contractile function and drives a desmosome-linked disease phenotype. Science Translational Medicine. 13 (603), (2021).
- Ribeiro, M. C., et al. A new versatile platform for assessment of improved cardiac performance in human-engineered heart tissues. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 214 (2022).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Mannhardt, I., et al. Human engineered heart tissue: Analysis of contractile force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
- Mannhardt, I., et al. Blinded contractility analysis in hiPSC-cardiomyocytes in engineered heart tissue format: Comparison with human atrial trabeculae. Toxicological Sciences. 158 (1), 164-175 (2017).
- Saleem, U., et al. Force and calcium transients analysis in human engineered heart tissues reveals positive force-frequency relation at physiological frequency. Stem Cell Reports. 14 (2), 312-324 (2020).
- Thavandiran, N., et al. Functional arrays of human pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Scientific Reports. 10 (1), 6919 (2020).
- Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
- Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
- Bose, P., Huang, C. Y., Eyckmans, J., Chen, C. S., Reich, D. H. Fabrication and mechanical properties measurements of 3D microtissues for the study of cell-matrix interactions. Methods in Molecular Biology. 1722, 303-328 (2018).
- Zhang, W., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CMs) in 3D collagen matrix: Effects of niche cell supplementation and mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 49, 204-217 (2017).
- van Neste, C. Advances in bioreactor design and multi-dimensional analysis for assessing maturation phenotype of human engineered cardiac tissues. PhD thesis. Icahn School of Medicine at Mount Sinai. , (2022).
- Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
- Salazar, B. H., Cashion, A. T., Dennis, R. G., Birla, R. K. Development of a cyclic strain bioreactor for mechanical enhancement and assessment of bioengineered myocardial constructs. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (4), 533-545 (2015).
- Putame, G., et al. Application of 3D printing technology for design and manufacturing of customized components for a mechanical stretching bioreactor. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 3957931 (2019).
- Akintewe, O. O., Roberts, E. G., Rim, N. -. G., Ferguson, M. A. H., Wong, J. Y. Design approaches to myocardial and vascular tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 19, 389-414 (2017).
- Chen, G., et al. Phospholamban as a crucial determinant of the inotropic response of human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes and engineered 3-dimensional tissue constructs. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (1), 193-202 (2015).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Beauchamp, P., et al. 3D co-culture of hiPSC-derived cardiomyocytes with cardiac fibroblasts improves tissue-like features of cardiac spheroids. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 14 (2020).
- Campostrini, G., et al. functional analysis and applications of isogenic three-dimensional self-aggregating cardiac microtissues from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 16 (4), 2213-2256 (2021).
- Swiatlowska, P., Iskratsch, T. Tools for studying and modulating (cardiac muscle) cell mechanics and mechanosensing across the scales. Biophysical Reviews. 13 (5), 611-623 (2021).
- Zhao, Y., et al. Engineering microenvironment for human cardiac tissue assembly in heart-on-a-chip platform. Matrix Biology. 85-86, 189-204 (2020).
- Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSC-derived engineered cardiac tissues. Methods in Molecular Biology. 2320, 171-180 (2021).
- Wang, E. Y., et al. Biowire model of interstitial and focal cardiac fibrosis. ACS Central Science. 5 (7), 1146-1158 (2019).
- Zhao, Y., et al. A platform for generation of chamber-specific cardiac tissues and disease modeling. Cell. 176 (4), 913-927 (2019).
- Lee, E. K., et al. Machine learning of human pluripotent stem cell-derived engineered cardiac tissue contractility for automated drug classification. Stem Cell Reports. 9 (5), 1560-1572 (2017).
- Batalov, I., Feinberg, A. W. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells using monolayer culture. Biomarker Insights. 10, 71-76 (2015).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Penefsky, Z. J., Buckley, N. M., Litwak, R. S. Effect of temperature and calcium on force-frequency relationships in mammalian ventricular myocardium. Pflugers Archiv. 332 (4), 271-282 (1972).
- Bers, D. M. . Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , (2001).
- Kanaya, N., Gable, B., Wickley, P. J., Murray, P. A., Damron, D. S. Experimental conditions are important determinants of cardiac inotropic effects of propofol. Anesthesiology. 103 (5), 1026-1034 (2005).
- Galende, E., et al. Amniotic fluid cells are more efficiently reprogrammed to pluripotency than adult cells. Cellular Reprogramming. 12 (2), 117-125 (2010).
- Wacker-Gussmann, A., Strasburger, J. F., Cuneo, B. F., Wakai, R. T. Diagnosis and treatment of fetal arrhythmia. American Journal of Perinatology. 31 (7), 617-628 (2014).
- Federmann, M., Hess, O. M. Differentiation between systolic and diastolic dysfunction. European Heart Journal. 15, 2-6 (1994).
- Knight, W. E., et al. Maturation of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes enables modeling of human hypertrophic cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 16 (3), 519-533 (2021).
- Ma, Z., et al. Contractile deficits in engineered cardiac microtissues as a result of MYBPC3 deficiency and mechanical overload. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 955-967 (2018).
- de Lange, W. J., et al. Human iPSC-engineered cardiac tissue platform faithfully models important cardiac physiology. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 320 (4), H1670-H1686 (2021).
- Hiranandani, N., Varian, K. D., Monasky, M. M., Janssen, P. M. L. Frequency-dependent contractile response of isolated cardiac trabeculae under hypo-, normo-, and hyperthermic conditions. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1727-1732 (2006).
- Puglisi, J. L., Bassani, R. A., Bassani, J. W., Amin, J. N., Bers, D. M. Temperature and relative contributions of Ca transport systems in cardiac myocyte relaxation. The American Journal of Physiology. 270 (5), H1772-H1778 (1996).
- Puglisi, J. L., Yuan, W., Bassani, J. W., Bers, D. M. Ca(2+) influx through Ca(2+) channels in rabbit ventricular myocytes during action potential clamp: Influence of temperature. Circulation Research. 85 (6), e7-e16 (1999).
- Li, R. A., et al. Bioengineering an electro-mechanically functional miniature ventricular heart chamber from human pluripotent stem cells. Biomaterials. 163, 116-127 (2018).
- Sharma, A., et al. Biomanufacturing in low Earth orbit for regenerative medicine. Stem Cell Reports. 17 (1), 1-13 (2022).
- Strauss, D. G., Wu, W. W., Li, Z., Koerner, J., Garnett, C. Translational models and tools to reduce clinical trials and improve regulatory decision making for QTc and proarrhythmia risk (ICH E14/S7B updates). Clinical Pharmacology & Therapeutics. 109 (2), 319-333 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
