Summary
Vi rapporterar en steg-top, flexibel miljökammare för time-lapse-avbildning av levande celler med upprätt stimulerad Raman-spridningsmikroskopi med överförd signaldetektering. Lipiddroppar avbildades i SKOV3-celler behandlade med oljesyra i upp till 24 timmar med ett tidsintervall på 3 minuter.
Abstract
Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi är en etikettfri kemisk bildteknik. Levande cellavbildning med SRS har visats för många biologiska och biomedicinska tillämpningar. Långvarig time-lapse SRS-avbildning av levande celler har dock inte antagits allmänt. SRS-mikroskopi använder ofta ett vattennedsänkningsmål med hög numerisk bländare (NA) och en hög NA-oljekondensor för att uppnå högupplöst avbildning. I detta fall är klyftan mellan målet och kondensorn bara några millimeter. Därför kan de flesta kommersiella miljökammare inte användas för SRS-avbildning på grund av deras stora tjocklek med ett styvt glasskydd. Detta dokument beskriver design och tillverkning av en flexibel kammare som kan användas för time-lapse live-cellavbildning med överförd SRS-signaldetektering på en upprätt mikroskopram. Kammarens flexibilitet uppnås genom att använda ett mjukt material - en tunn naturgummifilm. Den nya kapslingen och kammardesignen kan enkelt läggas till i en befintlig SRS-bildinstallation. Testerna och de preliminära resultaten visar att det flexibla kammarsystemet möjliggör stabil, långsiktig, time-lapse SRS-avbildning av levande celler, som kan användas för olika bioimaging-applikationer i framtiden.
Introduction
Optisk mikroskopi används för att observera mikrostrukturerna i prover. Optisk avbildning är snabb, mindre invasiv och mindre destruktiv än andra tekniker1. Levande cellavbildning med optisk mikroskopi utvecklas för att fånga dynamiken hos odlade levande celler under en lång period2. Olika typer av optiska kontraster ger distinkt information om biologiska prover. Till exempel visar optisk fasmikroskopi den subtila skillnaden i brytningsindex över provet3. Fluorescensmikroskopi används ofta för att avbilda specifika biomolekyler eller cellulära organeller. Emellertid resulterar bredbandsexcitations- och emissionsspektra för fluorescens vanligtvis i spektral överlappning när flerfärgad avbildning utförs4. Fluorescerande molekyler är ljuskänsliga och kan blekas efter långvarig, periodisk ljusexponering. Dessutom kan fluorescensmärkning förändra biodistributionen av molekylerna i celler5. SRS-mikroskopi är en etikettfri kemisk bildteknik6. Kontrasten hos SRS bygger på vibrationsövergången av specifika kemiska bindningar. Vibrationsfrekvensen för en kemisk bindning uppvisar ofta en smal spektralbandbredd, vilket gör det möjligt att avbilda flera Raman-band i samma prover7. SRS-mikroskopi är ett unikt verktyg för avbildning av levande celler, vilket ger flera kemiska kontraster på ett etikettfritt sätt8.
Medan SRS-avbildning av ofärgade celler har använts för många studier, har långvarig time-lapse SRS-avbildning av levande celler inte antagits allmänt. En anledning är att kommersiella öppna kammare inte kan användas direkt för SRS-avbildning på grund av deras stora tjocklek 9,10,11,12. Dessa kammare med glaslock är oftast konstruerade för ljusfälts- eller fluorescensavbildning med ett enda högt NA-mål med ett bakåtdetekteringsschema. SRS-avbildning föredrar dock överförd detektion med både ett högt NA-mål och en hög NA-kondensor, vilket bara lämnar ett mycket kort mellanrum (vanligtvis några millimeter) mellan målet och kondensorn. För att övervinna detta problem designade vi en flexibel kammare med ett mjukt material för att möjliggöra time-lapse SRS-avbildning av levande celler med hjälp av en upprätt mikroskopram. I denna design var vattendoppningsmålet inneslutet i den mjuka kammaren och kan fritt röra sig i tre dimensioner för fokuserings- och bildändamål.
Den optimala temperaturen för odling av de flesta däggdjursceller är 37 °C, medan rumstemperaturen alltid är 10° lägre än detta. Temperatur högre eller lägre än 37 °C har en dramatisk effekt på celltillväxthastigheten13. Därför krävs temperaturkontroll av cellodlingsmiljön i ett levande cellavbildningssystem. Det är känt att temperaturinstabilitet kommer att leda till oskärpningsproblem under långvarig avbildning14. För att uppnå en stabil miljö på 37 °C byggde vi en stor kapslingskammare för att täcka hela mikroskopramen, inklusive ett värmeisoleringsskikt under mikroskopet (figur 1). I den stora temperaturkontrollkammaren hjälper den lilla flexibla kammaren till att noggrant bibehålla den fysiologiska fuktigheten och pH-värdet via det reglerade luftflödet kompletterat med 5% CO 2 (figur 2). Kamrarnas temperatur och fuktighet mättes för att bekräfta att dubbelkammardesignen gav det optimala cellodlingsförhållandet för celltillväxt under långsiktig, periodisk SRS-avbildning (figur 3). Vi demonstrerade sedan tillämpningen av systemet för time-lapse-avbildning och spårning av lipiddroppar (LD) i SKOV3-cancerceller (figur 4, figur 5 och figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bygg mikroskopets miljöhölje
OBS: Detta stora mikroskop miljöhölje används för att styra temperaturen i mikroskopkroppen och bildmiljön som ska stabiliseras vid 37 ° C (figur 1A).
- Markera placeringen av fötterna på SRS-mikroskopramen och det motoriserade steget med en markörpenna på det optiska bordet. Montera två Irismembran framför galvanometerskannern i mikroskopet och justera så att pumpen och Stokes laserstrålar passerar genom mitten av Irismembranen.
- Ta bort mikroskopramen och scenen från det optiska bordet.
- Lägg silikongummiarket (storlek: 31 x 29 tum, tjocklek: 1/8 tum) på det optiska bordet (figur 1B).
- Skär silikongummit längs märkena med en kniv, ta bort små gummibitar och placera de fyrkantiga MICA-keramiska arken (storlek: 6 x 6 tum, tjocklek: 1/4 tum) på samma platser.
OBS: MICA keramik är ett lättmaskinellt material15. Det är lika hårt som aluminium men är en utmärkt värmeisolator. MICA keramiska plåtar användes för att stoppa värmeöverföringen från metallmikroskopramen och scenen till det optiska bordet i rostfritt stål. Några genomgående hål bör borras på MICA-arken för att möjliggöra användning av 1/4-20 skruvar för montering av ramens fötter och scenen. - Flytta mikroskopramen och scenen tillbaka till det optiska bordet och rikta försiktigt in fötterna på MICA-keramiska ark längs markörlinjerna. Använd 1/4-20 skruvar för att montera ramen och scenen på bordet.
- Justera den optiska SRS-banan. Justera spegelfästena på spegel 1 och spegel 2 så att laserstrålen passerar genom mitten av de två förmonterade irismembranen (figur 2).
OBS: Tekniska detaljer om det laboratoriebyggda SRS-mikroskopet som används för det aktuella live-cellavbildningsarbetet beskrivs tidigare16. Pumpens och Stokes strålars pulsbredd är ~3-4 hk med glasstavsdispersion. Systemet styrs med programvaran ScanImage17 . - Ovanpå denna värmeisoleringsfundament, montera miljöhöljet för att täcka hela mikroskopramen med fem bitar av stora polykarbonatplåtar (storlek: 31 x 29 x 28 tum, tjocklek: 0,25 tum).
OBS: Storleken på kapslingslådan bestäms utifrån dimensionerna på mikroskopramen och scenen. Frontpanelen på mikroskophöljeslådan måste tas bort tillfälligt för att installera den flexibla kammaren och ladda cellodlingsskålen.- För att montera höljet, utför enkelt bearbetningsarbete, inklusive skärning, borrning och gängning av skruvhål på varje kant av polykarbonatarken. Skär två stora hål med en diameter på 2,6 tum till höger och vänster ark i höljet för att passa inlopps- respektive utloppsröret. Skär ett litet hål med en diameter på 5 mm på bakplåten så att laserstrålarna kan komma in i höljet.
- Försegla lådans kanter och gränssnitt med aluminiumfolietejp.
- Anslut den flexibla kanalslangen till inlopps- och utloppsportarna på kapslingsboxen för att tillåta cirkulerat varmt luftflöde pumpat och styrt av värmemodulen. Placera värmesensorn på värmemodulen i den flexibla kammaren där cellerna odlas och avbildas. Ställ in måltemperaturen på 37 °C.
OBS: En diffusor kan användas för att få en jämnare luftflödesfördelning i miljöhöljet.
2. Montera den flexibla kammaren
- Montera den bearbetade ihåliga cylindriska aluminiumbiten 1 (material: aluminium 6061) på objektivets nosstycke med tre skruvar (figur 2).
- Montera den bearbetade ihåliga cylindriska aluminiumbiten 2 på provhållaren med fyra 1/4-20 skruvar (figur 2).
Anmärkning: Provhållaren måste modifieras för att hålla 50 mm täck cellodlingsskålen med glasbotten. Borra ett genomgående hål i mitten av provhållaren med en 1-7/8 tum hålsåg. Motborra hålet med en 50 mm hålsåg och behåll djupet på det genomgående hålet ~ 1 mm. - Montera provhållaren med aluminiumstycket 2 på det motoriserade steget och montera det med skruvar.
- Placera naturgummifilmhylsan (tjocklek: 0,01 tum, limmad med cyanoakrylatlim) mellan de två bearbetade aluminiumbitarna och montera den med gummiband i varje ände.
- Anslut den komprimerade CO2-cylindern till gasblandarmodulen med rätt slang och kontakter. Ställ in CO2-ingångstrycket på 20-25 psi. Använd en inbyggd CO 2-sensor och en styrenhet för att säkerställa att luftblandarmodulen kan reglera och blanda 5% CO2 i luftflödet. Använd infogade filter för att rensa luftflödet.
- Använd rätt slangar och kontakter, led den blandade luften (med 5% CO2) till den försteriliserade vattenflaskan placerad på värmeplattan och led sedan den fuktade luften till den flexibla kammaren. Ställ in värmeplattan på 37 °C. Bubbla luftflödet i varmt vatten för att öka luftfuktigheten.
3. Förberedelse för time-lapse live-cell SRS-avbildningsexperiment
- Torka av alla delar av den flexibla kammaren med 70% etanol, inklusive nässtycket, vattendoppningsmålet och provhållaren.
- Dekontaminera hela kapslingssystemet med en UV-lampa placerad i höljet i 20 till 30 minuter.
OBS: Stanna inte i labbrummet under UV-desinfektionsprocessen för säkerhet. - Odla SKOV3-celler i en 50 mm petriskål med glasbotten i 12 timmar under normala fysiologiska förhållanden i en vanlig inkubator.
OBS: Starta SKOV3-cellkulturen18 i ett vanligt biosäkerhetsskåp. - Koppla bort den bearbetade aluminiumbiten 2 från provhållaren genom att ta bort skruvarna.
OBS: Detta är sättet att öppna den flexibla kammaren för att ladda cellodlingsskålen. - Ladda cellodlingsskålen. Kom ihåg att tillsätta nedsänkningsolja på toppen av kondensorn innan du placerar cellodlingsskålen. Ta bort locket på skålen och immobilisera skålen med klämmorna.
OBS: För att undvika kontaminering bör alla operationer utföras med handskar. - Sänk målet i cellodlingsmediet för grov fokusering. Sänk aluminiumstycket 2 för att omsluta den flexibla kammaren och montera den på provhållaren med skruvar.
OBS: En 2 mm silikongummikudde är fäst på botten av aluminiumstycket 2 för att täta gapet tätt. - Ställ in lufttillförseln med 5% CO 2 och 19% O2 för normal cellodling med en luftflödeshastighet på 200 cc / min.
OBS: Ett lägre luftflöde kan användas. Det beror på hur väl den flexibla kammaren är förseglad.
4. Genomföra time-lapse live-cell SRS-avbildningsexperiment
- Ställ in laservåglängden till 805 nm för att rikta in sig på 2854 cm-1 Raman-skiftet, vilket tillskrivs vibrationen av CH2-kemiska bindningar. Använd låg lasereffekt för att minska fotoskador på cellerna. För att följa detta protokoll, använd ~ 15 mW genomsnittlig effekt för pumplasern och ~ 7,5 mW för Stokes-lasern (fast vid 1,045 nm) för långvarig levande cellavbildning.
OBS: Högre lasereffekt ger bättre SRS-bildkvalitet. Men för hög lasereffekt kommer att inducera fotoskador på levande celler. Det finns en kompromiss mellan bildkvalitet och fotoskador. - Justera och fokusera målet för att uppnå bra SRS-avbildning av cellerna med hjälp av FOCUS-knappen på programvarans MAIN CONTROLS-panel . Om du vill utföra snabb fokusering ställer du in pixelnumret till 512 × 512 pixlar med en pixeluppehållstid på 4,8 μs på panelen KONFIGURATION .
- Ställ in ingångsområdet för låsförstärkaren (vanligtvis 5 mV) till två gånger den maximala signalspänningen. Ställ in lågpassfiltret så att det är detsamma som pixeluppehållstiden (4,8 μs).
OBS: Olika labbbyggda SRS-system kan använda olika datainsamlingsinställningar. - När du har uppnått bra fokusering ställer du in bildupplösningen till 2 048 × 2 048 pixlar för ett synfält på 175 μm2 för förvärv av högkvalitativa bilder. Kontrollera SAVE-funktionen på panelen MAIN CONTROLS och kontrollera SRS-kanalen på panelen CHANNELS . Ställ in intervalltiden mellan två bildrutor till 180 s (3 min) på kanalen MAIN CONTROLS. Ställ in förvärvsnumret på 480 för timelapse-avbildning under 24 timmar.
OBS: En lägre bildupplösning kan användas baserat på syftet med experimenten. - Starta automatisk bildinsamling med hjälp av LOOP-funktionen på MAIN CONTROLS-panelen .
OBS: Kontrollera om det finns fokaldrift på grund av temperaturinstabilitet under den första timmen av avbildningen. Den första timmens avbildning kanske inte är stabil. Kontrollera fokuseringen var 2-3: e timme under time-lapse-bildsessionen. - Bearbeta de insamlade bilderna med ImageJ19. Använd följande två metoder för LD-kvantifiering: (i) LD/cellkroppsareaförhållandet och (ii) den genomsnittliga SRS-intensiteten för totala LDs. Mät cellkroppsytan genom att tröskelmarkera och nollställa de icke-cellulära pixlarna i SRS-bilderna vid 2 854 cm-1. Mät LD-arean och intensiteten genom att trösla och nollställa de icke-LD-pixlarna i SRS-bilderna.
OBS: Mer detaljer om SRS bildbehandling rapporterades tidigare16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tillverkade och monterade det flexibla kammarsystemet för time-lapse SRS-avbildning (figur 1 och figur 2) och utvärderade sedan systemets prestanda. Temperaturen inuti mikroskopets miljöhölje nådde den förväntade 37 ° C inom 1 h, vilket inte signifikant påverkade rumstemperaturen (figur 3A). Temperaturen i den flexibla kammaren nådde 37 °C på 1,5 timmar och hölls stabilt vid 37 °C i minst 24 timmar (figur 3B). Den relativa luftfuktigheten i den flexibla kammaren kan nå 85% på 1 h och sedan bibehållas i minst 24 h (figur 3C). De uppmätta temperatur- och fuktighetsdata bekräftar att detta system kan ge en optimal miljö för långsiktig celltillväxt.
Live-cell imaging med SRS har tillämpats på många biologiska och biomedicinska studier 20,21,22,23,24. I synnerhet har SRS-avbildning av etikettfria LD i levande celler för att förstå lipidmetabolism i cancer väckt stor uppmärksamhet16,25,26. Med hjälp av det designade flexibla kammarsystemet utförde vi först time-lapse SRS-avbildning av levande SKOV3-celler i 24 timmar med ett tidsintervall på 3 min (figur 4). Videodata visade den snabba och aktiva rörelsen av intracellulära LDs med en tidsupplösning på 3 min. I slutet av den 24 timmar långa avbildningssessionen visade cellerna fortfarande normal morfologi och densitet, vilket indikerar att cellerna var friska. Vi avbildade sedan SKOV3-celler behandlade med oljesyra (OA) och spårade den dynamiska processen för LD-ackumulering inom 10 timmar (figur 5A).
LD-mängderna kvantifierades i de OA-behandlade SKOV3-cellerna på två sätt (LD till cellkroppsareaförhållandet och total SRS-intensitet hos LDs) med hjälp av ImageJ19. Resultaten indikerar att mängden LD (i storlek och antal) fortsatte att öka under 10 timmar (figur 5B). Vi demonstrerade också samtidig framåt-SRS-avbildning av LD (pseudofärg grön) och bakåt tvåfotonfluorescens (TPF) avbildning av lysosomer (pseudofärg röd) märkt med ett fluorescensfärgämne DND-189 (figur 6). Det noteras att SRS / TPF dualmodalitetsavbildning kan användas för att analysera samlokalisering av två cellulära fack. I detta experiment observerades en mycket låg grad av samlokalisering av LD och lysosomer, vilket indikerades av de små gula regionerna. Sammantaget visar dessa resultat att det flexibla kammarsystemet möjliggör stabil, långsiktig, time-lapse SRS-avbildning av levande celler, som kan användas för olika avbildningsapplikationer i framtiden.
Figur 1: Det flexibla kammarsystemet för time-lapse SRS-avbildning av levande celler. (A) Schematisk bild av det flexibla kammarsystemet för time-lapse SRS-avbildning av levande celler. (B) Bilden till vänster visar värmeisoleringsskiktet med hjälp av en silikongummiduk och MICA keramiska dynor under mikroskopramen och scenen. Bilden till höger visar miljömikroskophöljet och den flexibla kammaren. Förkortningar: SRS = stimulerad Ramanspridning; CCM = kubikcentimeter per minut. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk och bilder av den flexibla kammaren med SRS optiska väg, vilket möjliggör tredimensionell fri rörlighet för vattendoppningsmålet för fokusering och avbildning. De vänstra bilderna visar de två bearbetade aluminiummodulerna anslutna till ett kommersiellt objektivt nosstycke och en modifierad provhållare. De nedre bilderna visar monteringssystemet med flexibla kammare. Förkortning: SRS = stimulerad Ramanspridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Temperatur- och fuktighetsdata för mikroskopkammaren och den flexibla kammaren. (A) Uppmätta temperaturdata för mikroskophöljet och laboratorierumstemperaturen, upp till 12 timmar. (B) Uppmätta temperaturdata (genomsnitt vid 37 °C) i den flexibla kammaren, upp till 24 timmar. (C) Uppmätta uppgifter om relativ luftfuktighet (genomsnitt vid 85 %) i den flexibla kammaren. upp till 24 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa 24 bildrutor för timelapse SRS-avbildning. Time-lapse SRS-avbildning (vid 2 854 cm-1) av levande SKOV3-celler med hjälp av den flexibla kammaren, upp till 24 timmar. I detta experiment registrerades 480 bilder med ett fast tidsintervall på 3 min. Cellerna odlades under normala förhållanden. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Time-lapse SRS-avbildning och lipiddroppkvantifiering. (A) Representativ 10 bilder av timelapse SRS-avbildning (vid 2 854 cm-1) av levande SKOV3-celler behandlade med 500 μM OA, upp till 10 timmar, med användning av den flexibla kammaren. I detta experiment registrerades 200 bilder med ett fast tidsintervall på 3 min. Skalstapel = 50 μm. (B) Mängden LD kontra tid (0-10 h) kvantifierades på två sätt (LD/cellkroppsareaförhållande och total SRS-intensitet för LDs) med hjälp av tröskelfunktionen och partikelanalysfunktionerna i ImageJ. Förkortningar: SRS = stimulerad Ramanspektroskopi; OA = oljesyra; LDs= lipiddroppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Timelapse, samtidig SRS och tvåfotonfluorescensavbildning för LD och lysosomer. Time-lapse, samtidig SRS (vid 2 854 cm-1) och tvåfotonfluorescensavbildning för LD (pseudofärg grön) och lysosomer (röd), upp till 2 timmar. Cellerna behandlades med ett fluorescensfärgämne (LysoSensor DND-189, 1 μM) i 1 h före avbildning. Bilder togs var 3: e minut. Skalstapel = 50 μm. En låg grad av samlokalisering av LD och lysosomer observerades, indikerad med den gula färgen. Förkortningar: SRS = stimulerad Ramanspektroskopi; LDs= lipiddroppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse live-cell SRS-mikroskopi är en alternativ bildteknik för molekylspårning på ett etikettfritt sätt. Jämfört med fluorescensmärkning är SRS-avbildning fri från fotoblekning, vilket möjliggör långtidsövervakning av molekyler. Hittills är dock det levande cellavbildningssystemet på en upprätt SRS-mikroskopi inte kommersiellt tillgängligt. I detta arbete utvecklades ett levande cellavbildningssystem med en stabil värmeisolerad mikroskophöljeslåda och en flexibel inre mjukkammare för att möjliggöra överförd SRS-time-lapse-avbildning. I denna inställning upprätthåller den stora kapslingslådan temperaturstabilitet vid 37 ° C, medan den inre mjuka kammaren levererar fuktad luft för att skapa en optimal cellodlingsmiljö. Den flexibla öppna kammaren som demonstreras i detta arbete möjliggör ett enkelt arbetsflöde för långvarig SRS-avbildning av levande celler. Celler som sås i en glasskål kan först beredas och odlas i en vanlig inkubator innan de överförs till den flexibla kammaren på scenen för avbildning. En alternativ lösning för att utföra SRS-avbildning med levande celler är att använda en sluten flödescell, inklusive mikrofluidik- och flödescytometriplattformarna27,28,29,30. Det är möjligt att designa en flödescell med lägre tjocklek. Att odla celler i en perfusionskammare kan dock vara tekniskt utmanande31.
Fokaldrift är ett vanligt problem vid avbildning av levande celler32. Som en multifotonprocess kräver SRS-signalgenerering en tät fokusering av laserstrålarna och därför är SRS-mikroskopi mycket känslig för fokaldrift. Temperaturinstabilitet är en viktig faktor för att inducera fokaldrift. För att förbättra termisk stabilitet var hela mikroskopet inneslutet med värmeisoleringsmaterial. Men i vissa bildsessioner upplevde vi fortfarande fokaldrift efter 2-3 timmars avbildning. SRS mikroskopiska avbildning är också känslig för vibrationer, vilket kan förstöra fokusering. Ett vibrationsdämpande optiskt bord hjälper till att minska vibrationer för att uppnå stabil bildbehandling. För att lösa fokaldriftproblemet kan autofokusteknik användas i framtida experiment33.
Desinfektionsproceduren för bildsystemet är avgörande för att undvika kontaminering av cellerna, särskilt för vattennedsänkningsmålet, som direkt kommer i kontakt med cellodlingsmediet. Det ska vara säkert att använda 70% etanol för rengöring av linsen. Eftersom UV-ljus endast effektivt kan desinficera föremålens yta, monterades fyra UV-lampor på olika platser i kapslingslådan för att utföra desinfektion i dessa experiment. UV-ljuset kan dock försämra plastkomponenterna i bildsystemet. I det här fallet kan man använda aluminiumfolie för att linda och täcka plastdelarna. För levande cellavbildning rekommenderas antibiotika (vanligtvis 100 enheter / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin i odlingsmediet).
Vi avbildade och kvantifierade LD i levande cancerceller i dessa experiment. För dessa experiment var ett tidsintervall på 3 minuter rimligt. Det noteras att bildtidsintervallet kan ändras beroende på forskningsprojektets behov. Till exempel, för att spåra en enda LD i en levande cell, kan ett mindre än 1 minuters tidsintervall krävas. Däremot är ett längre tidsintervall på några minuter tillräckligt för att spåra långsamma biologiska processer34.
SRS-avbildning använder högre lasereffekt för excitation än många andra optiska avbildningstekniker, vilket kan vara utmanande för långvarig tidsfördröjning SRS-avbildning av levande celler. SRS-avbildning av de ursprungliga biomolekylerna är ännu mer utmanande på grund av det lilla Raman-tvärsnittet av de kemiska bindningarna35. I dessa experiment användes en 15 mW pumplaser vid 805 nm och 7,5 mW Stokes laser vid 1 045 nm, och ingen signifikant fotodamage observerades inom 24 timmar med ett tidsintervall på 3 minuter. Användningen av känsliga Raman-taggar kan minska lasereffekten ytterligare36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza och James Walsh) vid Binghamton University för design, tillverkning och testning av mikroskophöljet. Vi tackar Scott Hancock, Olga Petrova och Fabiola Moreno Olivas vid Binghamton University för hjälpsamma diskussioner. Denna forskning stöddes av National Institutes of Health under Award Number R15GM140444.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R.
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P.
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al.
