Summary
Métodos para medir a atividade de ALDH1A1 em células vivas são críticos na pesquisa do câncer devido ao seu status como um biomarcador de tronco. Neste estudo, empregamos uma sonda fluorogênica isoforme-seletiva para determinar os níveis relativos de atividade de ALDH1A1 em um painel de cinco linhagens de células de câncer de ovário.
Abstract
A recidiva após o tratamento do câncer é frequentemente atribuída à persistência de uma subpopulação de células tumorais conhecidas como células-tronco cancerosas (CSCs), que são caracterizadas por sua notável capacidade de iniciação tumoral e auto-renovação. Dependendo da origem do tumor (por exemplo, ovários), o perfil de biomarcadores de superfície da CSC pode variar drasticamente, tornando a identificação de tais células por meio de coloração imuno-histoquímica um esforço desafiador. Ao contrário, a aldeído desidrogenase 1A1 (ALDH1A1) tem emergido como um excelente marcador para identificar CSCs, devido ao seu perfil de expressão conservado em quase todas as células progenitoras, incluindo CSCs. A isoforma ALDH1A1 pertence a uma superfamília de 19 enzimas que são responsáveis pela oxidação de vários aldeídos endógenos e xenobióticos aos produtos correspondentes do ácido carboxílico. desenvolveram recentemente o AlDeSense, uma sonda "turn-on" isoform-seletiva para a detecção da atividade de ALDH1A1, bem como um reagente de controle de correspondência não reativo (Ctrl-AlDeSense) para explicar a coloração fora do alvo. Esta ferramenta isoform-seletiva já demonstrou ser uma ferramenta química versátil através da detecção da atividade de ALDH1A1 em células de leucemia mielóide K562, mamosferas e xenoenxertos CSC derivados de melanoma. Neste artigo, a utilidade da sonda foi mostrada através de experimentos adicionais de fluorimetria, microscopia confocal e citometria de fluxo, onde a atividade relativa de ALDH1A1 foi determinada em um painel de cinco linhagens de células de câncer de ovário.
Introduction
As células-tronco cancerosas (CSCs) são uma subpopulação de células tumorais que exibem propriedades semelhantes às células-tronco1. Semelhante aos seus homólogos não cancerosos, os CSCs possuem a extraordinária capacidade de se auto-renovar e proliferar. Juntamente com outros mecanismos incorporados, como a regulação positiva dos transportadores de de ligação de ATP, as CSCs são frequentemente poupadas dos esforços iniciais de remoção cirúrgica, bem como da terapia adjuvante subsequente2. Devido ao seu papel crítico na resistência ao tratamento3, recidiva4 e metástase5, as CSCs tornaram-se uma prioridade na pesquisa do câncer. Embora haja uma variedade de antígenos de superfície celular (por exemplo, CD133) que podem ser usados para identificar CSCs6, alavancar a atividade enzimática de aldeídos desidrogenases (ALDHs) encontradas no citoplasma tem emergido como uma alternativa atraente7. ALDHs são uma superfamília de 19 enzimas responsáveis por catalisar a oxidação de aldeídos endógenos e xenobióticos reativos aos produtos correspondentes do ácido carboxílico8.
Em geral, a desintoxicação de aldeídos é crucial na proteção das células contra eventos indesejáveis de ligações cruzadas e estresse oxidativo que podem danificar a integridade das células-tronco9. Além disso, a isoforma 1A1 controla o metabolismo do ácido retinóico, que por sua vez influencia a haste via sinalização retinaldeído10. O AlDeSense 11,12, uma sonda de detecção baseada em atividade de pequenas moléculas (ABS) para detectar seletivamente a atividade de ALDH1A1, foi recentemente desenvolvido. Os projetos em ABS alcançam a detecção do analito através de uma mudança química em vez de um evento de ligação, permitindo alta seletividade e diminuição das respostas fora do alvo13,14,15,16. O princípio de projeto da sonda fluorogênica seletiva de isoformas baseia-se em um mecanismo de têmpera de transferência de elétrons (d-PeT) doador-fotoinduzido17, originário do grupo funcional aldeído, que serve para suprimir a assinatura fluorescente da sonda18. Após a conversão mediada por ALDH1A1 para o ácido carboxílico, o relaxamento radiativo é desbloqueado para produzir um produto altamente fluorescente. Como a têmpera d-PeT nunca é 100% eficiente, a fluorescência residual que pode levar a possíveis resultados falso-positivos foi considerada ao estabelecer este ensaio através do desenvolvimento de Ctrl-AlDeSense, um reagente não responsivo com características fotofísicas correspondentes (por exemplo, rendimento quântico) e um padrão de coloração citoplasmático idêntico nas células. Quando usado em conjunto, este emparelhamento único pode distinguir de forma confiável células com alta atividade de ALDH1A1 daquelas que exibem baixos níveis via fluorimetria, imagem molecular e citometria de fluxo. Várias vantagens importantes estão associadas ao uso de corantes ativados por isoforma seletiva em relação aos métodos tradicionais de imuno-histoquímica. Por exemplo, as CSCs são hipotetizadas para serem enterradas profundamente dentro de um tumor e, portanto, são mais acessíveis a uma molécula pequena em relação a anticorpos grandes19. Além disso, o produto fluorescente transformado não modifica covalentemente nenhum componente celular, o que significa que pode ser prontamente removido através de ciclos de lavagem para deixar um CSC em um estado não modificado. Por fim, a resposta ativada identifica apenas células e funções viáveis, assim como o ensaio MTT, devido à sua dependência do cofator NAD+.
Figura 1: Esquema demonstrando o acionamento fluorescente do AlDeSense. O corante isoform-seletivo é ativado pela ALDH1A1 e pode ser usado para identificar a atividade elevada da ALDH1A1 em células cancerosas do ovário via fluorimetria, imagem molecular e citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em trabalhos anteriores, o ensaio de sonda fluorogênica isoform-seletiva estratificada com sucesso em células ALDH altas (ALDH+) de células ALDH baixas (ALDH-) em células K562 de leucemia crônica humana, células de câncer de mama humano MDA-MB-231 e células de melanoma murino B16F0. Isso é importante porque, para muitos tipos de câncer, a alta expressão da proteína ALDH1A1 significa pior prognóstico clínico20. Isso pressupõe que níveis elevados de ALDH1A1 são indicativos de CSCs que podem escapar do tratamento, desenvolver resistência e disseminar-se por todo o corpo. No entanto, no caso do câncer de ovário, há estudos relatando o achado oposto (alta expressão de ALDH1A1 está ligada à melhora da sobrevida das pacientes)21,22,23,24. Embora isso possa parecer contraditório à primeira vista, a expressão não necessariamente se correlaciona com a atividade enzimática, que pode ser influenciada por mudanças no microambiente tumoral (por exemplo, fluxo de pH, gradientes de oxigênio), disponibilidade do cofator NAD+ ou substratos de aldeídos, níveis de ácidos carboxílicos (inibição do produto) e modificações pós-traducionais que podem alterar a atividade enzimática25 . Além disso, o câncer de ovário é dividido em cinco tipos histológicos principais (seroso de alto grau, seroso de baixo grau, endometrioide, de células claras e mucinoso), os quais hipotetizamos que apresentarão níveis variáveis de atividade da ALDH1A126. Com o objetivo de investigar a atividade de ALDH1A1 em tumores ovarianos, um ensaio de sonda fluorogênica isoforme-seletiva foi empregado para identificar populações de ALDH1A1+ em um painel de cinco linhagens de células de câncer de ovário pertencentes aos diferentes tipos histológicos mencionados acima. As linhagens celulares testadas neste estudo incluem células BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 e PEO4, cobrindo histotipos de células claras e serosas. Neste trabalho, destacou-se a versatilidade e a generalizabilidade da sonda para identificar CSCs para os pesquisadores que buscam realizar estudos semelhantes em outras linhagens de células cancerosas imortalizadas, bem como em amostras de pacientes. O uso do AlDeSense lançará luz sobre as vias bioquímicas envolvidas na manutenção da CSC em microambientes teciduais complexos e potencialmente servirá como uma ferramenta clínica para determinar o prognóstico e medir a agressividade do câncer.
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Protocol
1. Medir a atividade total de ALDH1A1 em homogeneizados de células de câncer de ovário via fluorimetria
- Descongelar 1 × 106 células num balão de cultura de células T25 em 5 ml dos seguintes meios de cultura celular:
- IGROV-1 e PEO4: meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
- BG-1 e Caov-3: Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de SFB e 1% de P/S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 com SFB a 20%, P/S a 1% e insulina a 0,01 mg/mL.
- Manter as células numa incubadora a 37 °C e 5% CO2 durante duas a três passagens. Certifique-se de que as células não excedam 80%-90% de confluência antes da passagem.
- Tripsinizar as células em tripsina a 0,25% por 10 min, contá-las usando um contador de células automatizado e pellet 1 × 107 células por centrifugação (180 × g) a 25 °C por 5 min.
- Remova o sobrenadante cuidadosamente por aspiração, lave o pellet ressuspendendo as células em 1 mL de PBS 1x e repeletize as células por centrifugação nas mesmas condições descritas na etapa 4.
- Ressuspender as células em solução de 1x inibidor de protease em 1x PBS. Utilizar 1 ml desta solução por 2,5 × 106 células.
- Sonicar a suspensão celular sobre gelo por 2 min (pulso de 1 s, amplitude de 40%) com uma sonda homogeneizadora de células.
- Frações insolúveis/membrana em pellet por centrifugação (3.200 × g) a 25 °C por 15 min. Retire e mantenha o sobrenadante, pois este é o homogeneizado que será utilizado nas etapas subsequentes. Separe os homogeneizados em três cubetas para realizar o experimento em triplicata.
- Adicione a sonda ao homogeneizado para obter uma concentração final da sonda de 4 μM. Pipetar três vezes para cima e para baixo para misturar bem a solução.
- Medir o sinal fluorescente imediatamente após a adição e após os tempos de incubação desejados em um fluorímetro. O tempo de incubação pode ser otimizado para ver o máximo de dobra girando (1 h neste experimento). O tempo de incubação deve ser constante em todas as linhagens celulares comparadas.
- Ajuste o comprimento de onda de excitação para 496 nm.
- Ajuste a emissão para 510-600 nm.
- Defina a largura da fenda para 0,5 mm.
- Pipetar a solução para uma cubeta de quartzo de 1 mL, colocar no fluorímetro e bater varredura.
- Divida a intensidade final da fluorescência a 516 nm (comprimento de onda fluorescente máximo) pela intensidade no mesmo comprimento de onda da leitura inicial para determinar a ativação da dobra do corante seletivo de isoformas.
2. Uso de microscopia de fluorescência para obtenção de imagens de células com alta atividade de ALDH1A1
- Descongelar 1 × 106 células num frasco de cultura de células T25 em 5 ml do meio de cultura celular adequado.
- Manter as células numa incubadora a 37 °C e 5% CO2 durante duas a três passagens. Certifique-se de que as células não excedam 80%-90% de confluência antes da passagem.
- No dia anterior à imagem confocal, a placa 4 × 105 células em uma lâmina de câmara de 8 poços.
- Revestir o fundo de cada poço com poli-L-lisina (0,1 mg/mL, 100 μL por poço) por 10 min, aspirando posteriormente.
- Lave cada poço 3x adicionando água de grau de cultura celular (100 μL por poço) e aspirando.
- Tripsinizar as células em tripsina a 0,25% por 10 min, contá-las usando um contador de células automatizado e plaquear as células em 4 × 105 células por poço.
- Deixe as células se acomodarem e se fixarem durante a noite (12-16 h).
- Aspirar o meio de crescimento e adicionar o meio livre de soro (500 μL por poço), suplementado com 2 μM da sonda ou da sonda controle.
- Incubar com a sonda à temperatura ambiente durante 30 minutos e obter imagens imediatas das células.
- Ligue o microscópio confocal e ajuste para a amostra.
- Carregar a amostra cuidadosamente na menor ampliação; Encontre as células para garantir o posicionamento adequado.
- Verifique se a lente objetiva está com ampliação de 10x e localize as células.
- Para este experimento, são necessários o canal FITC (excitação: laser de 488 nm; emissão: 516-521 nm) e o canal T-PMT (luz transmitida). Localize e concentre-se nas células usando T-PMT para se concentrar no mesmo plano z durante todo o experimento para remover o viés.
- Ajuste a potência do laser e o ganho de FITC para a configuração apropriada, onde o sinal das amostras Ctrl-AlDeSense AM é minimamente detectável, enquanto ainda vê o sinal nas amostras AlDeSense AM. Cada parâmetro pode ser ajustado deslizando a barra correspondente. As configurações podem ter que ser ajustadas algumas vezes para identificar os parâmetros corretos. Uma vez otimizado, complete o resto do experimento dentro dessa linhagem celular usando parâmetros idênticos.
- Tire três imagens por poço para um total de três poços por condição de tratamento (nove imagens no total). Concentre-se no plano adequado usando T-PMT para evitar viés em vez de usar o canal de fluorescência ou a imagem mesclada.
- Processar as imagens para determinar a porcentagem de células ALDH1A1+.
- Usando software de processamento de imagem, divida o arquivo czi em diferentes canais.
- Conte o número total de células e o número total de células fluorescentes.
- Para determinar a porcentagem de células ALDH1A1+, divida o número de células fluorescentes pelo número total de células em cada imagem. É imprescindível contar da mesma forma para cada imagem sem manipular as imagens, pois, por exemplo, ajustar o brilho pode adicionar uma variável de confusão.
3. Aplicação da citometria de fluxo na identificação de células com alta atividade da ALDH1A1
- Descongelar 1 × 106 células num frasco de cultura de células T25 em 5 ml do meio de cultura celular adequado.
- Manter as células numa incubadora a 37 °C e 5% CO2 durante duas a três passagens. Certifique-se de que as células não excedam 80%-90% de confluência antes da passagem.
- Tripsinizar, contar e peltar as células em um tubo de centrífuga de 15 mL por centrifugação (180 × g) a 25 °C por 5 min.
- Ressuspender as células em 1 mL de solução de sonda de 2 μM/sonda de controle em PBS. Balançar as células à temperatura ambiente por 60 min para garantir que a exposição ao corante seja uniforme.
- Após o período de incubação, pellet as células via centrifugação (180 × g) a 25 °C por 5 min. Ressuspender as células em 0,5 mL de PBS. Execute as células através de um filtro de células (malha de nylon de 35 μm) para remover aglomerados celulares que possam obstruir o citômetro de fluxo. Coloque imediatamente as células no gelo.
- Ligue o instrumento e execute o protocolo de inicialização.
- Verifique se há líquido de bainha e resíduos vazios.
- Execute as linhas com 10% de água sanitária e água por 5 min cada.
- Execute contas de controle de qualidade para garantir o funcionamento adequado.
- Na guia configurações, selecione FSC (dispersão direta), SSC (dispersão lateral) e FITC (isotiocianato de fluoresceína) para o filtro de fluorescência.
- Desenhe os gráficos a seguir para verificar viabilidade, singletes e fluorescência. Otimizar a potência do laser (específica para o instrumento do usuário) para que as populações celulares estejam dentro dos parâmetros fornecidos para análise posterior.
- Gráfico de dispersão FSC-A versus SSC-A: a população celular principal está próxima ao centro do gráfico.
- Gráfico de dispersão FSC-A versus FSC-W: banda horizontal estreita indicativa de singlets (em vez de aglomerados celulares).
- Gráfico de dispersão FITC-A versus FSC-A: observar a distribuição das células ordenadas pela sonda de giro fluorogênico seletivo de isoformas.
- Histograma FITC-A: observar a mudança na população com base no FITC para determinar a porcentagem de células ALDH1A1+.
- Para otimizar a potência do laser FITC, execute uma amostra com a sonda de modo que a cauda direita da curva do histograma esteja próxima do sinal máximo do FITC-A. Posteriormente, execute uma amostra com a sonda de controle. Um deslocamento populacional deve ser observável para revelar a faixa dinâmica máxima. A etapa de otimização da potência do laser pode ter que ser repetida várias vezes, mas a potência do laser não deve ser alterada em todas as amostras uma vez que uma configuração tenha sido designada para um experimento.
- Execute cada amostra para 10.000 contagens (feitas em triplicata).
- Repita o passo 3.12 para cada linhagem celular, pois haverá variabilidade na captação e na atividade da ALDH1A1.
- Após a conclusão da coleta da amostra, execute as linhas com água sanitária a 10% e água por 5 min cada, em seguida, inicie o desligamento do instrumento.
- Processe os dados usando o software de citometria de fluxo e armazene a população celular desejada. Defina os portões para que todos os eventos caiam no portão ALDH1A1- ou ALDH1A1+. Usando a seleção da porta retangular, ajuste a porta ALDH1A1- de modo que >99,5% dos eventos nas amostras da sonda de controle ocorram dentro dessa comporta. As demais células serão consideradas ALDH1A1+. Essas mesmas portas podem então ser aplicadas à amostra de sonda para quantificar o número de eventos considerados ALDH1A1- e ALDH1A1+.
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Representative Results
Atividade total de ALDH1A1 de homogeneizados de células cancerosas de ovário
As dobras médias para cada linhagem celular obtidas neste ensaio são: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); e OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (Figura 2).
Figura 2: Dobra fluorescente do corante seletivo de isoformas em homogeneizados de cada linhagem de células de câncer de ovário medida por fluorimetria (média ± desvio padrão) (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagem molecular de subpopulações de ALDH1A1+ em cultura de células de câncer de ovário
Ao incubar as células com uma sonda ou sonda controle, a porcentagem de células ALDH1A1+ foi determinada em cada linhagem celular. Ao sintonizar a potência e o ganho do laser para minimizar o sinal na amostra tratada com Ctrl-AlDeSense AM, o sinal de fluorescência foi otimizado nas células tratadas com AlDeSense AM (Figura 3). Pela contagem do número de células ALDH1A1+, determinou-se a porcentagem de células ALDH1A1+ como: BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); OVCAR-3 (39,8% ± 3,9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); e Caov-3 (93,7% ± 3,4%) (Figura 4).
Figura 3: Imagens confocais representativas . (A,C,E,G,I) Ctrl-AlDeSense AM células coradas e (B,D,F,H,J) AlDeSense AM células coradas. Da esquerda para a direita, as imagens exibem campo brilhante, fluorescência e mesclagem. As barras de escala são de 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Porcentagem média de células ALDH1A1+ em cada linhagem de células de câncer de ovário medida por microscopia confocal (média ± desvio padrão) (n = 9). A porcentagem de células ALDH1A1+ é BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); OVCAR-3 (39,8% ± 3,9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); e Caov-3 (93,7% ± 3,4%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Identificação da população de células ALDH1A1+ por citometria de fluxo
Com a aplicação da sonda fluorogênica isoform-seletiva, a população de células ALDH1A1+ foi identificada com sucesso em diferentes linhagens de células de câncer de ovário. Durante a análise pós-experimental dos dados, a população celular ALDH1A1+ dentro de cada linhagem celular pôde ser quantificada por gating para os 0,5% superiores das células mais brilhantes dentro da população tratada com Ctrl-AlDeSense AM (Figura 5). A análise do painel de células de câncer de ovário revelou que as porcentagens de células ALDH1A1+ são: BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); OVCAR-3 (7,6% ± 0,1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); e Caov-3 (70,1% ± 2,4%) (Figura 6).
Figura 5: Gráficos de dispersão representativos e sobreposição de histograma. (A,D,G,J,M) Gráficos de dispersão representativos da coloração Ctrl-AlDeSense AM após 1 h de incubação com células. (B,E,H,K,N) Gráficos de dispersão representativos da coloração AlDeSense AM após 1 h de incubação com células. (C,F,L,J,O) Sobreposição de histograma da coloração Ctrl-AlDeSense AM e AlDeSense AM dessas condições. As linhagens celulares coradas são (A-C) BG-1, (D-F) PEO4, (G-I) OVCAR-3, (J-L) IGROV-1 e (M-O) Caov-3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Porcentagem média de células ALDH1A1+ em cada linhagem de células de câncer de ovário medida por citometria de fluxo (média ± desvio padrão) (n = 3). A porcentagem de células ALDH1A1+ foi BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); OVCAR-3 (7,6% ± 0,1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); e Caov-3 (70,1% ± 2,4%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Enquanto várias isoformas de ALDH (i.e., ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 e ALDH3A1) têm sido associadas a CSCs, ALDH1A1 foi selecionado como alvo para este estudo porque, no contexto do câncer de ovário, os níveis de expressão são elevados 21,27, e essa isoforma demonstrou exacerbar a resistência a drogas28,29 e aumentar a tumorigênese 30,31 . Os resultados da imagem confocal e da citometria de fluxo estão de acordo na ordem do aumento da população de células ALDH1A1+. Além disso, os experimentos de homogeneização celular revelam a atividade média dentro de uma linhagem celular. Em conjunto, conclusões sobre a quantidade de atividade dentro das subpopulações ALDH1A1+ de cada linhagem celular podem ser extrapoladas. Pode-se concluir que BG-1 tem a menor atividade de ALDH1A1 e menor população ALDH1A1+. Vale ressaltar que selecionamos a linhagem celular BG1 para ser utilizada como controle negativo neste estudo, devido à expressão desprezível de ALDH1A1. Além disso, imagens confocais e citometria de fluxo revelaram a maior porcentagem de células ALDH1A1+ em células Caov-3, mas a atividade geral da linhagem celular foi apenas a terceira maior. Alternativamente, as células OVCAR-3 continham a terceira maior população ALDH1A1+, mas exibiam a maior atividade global. Extrapolando esses resultados, a subpopulação de células ALDH1A1+ OVCAR-3 tem maior atividade do que a subpopulação de células ALD1A1+ Caov-3. Através de uma análise mais aprofundada da população de ALDH1A1 dentro de linhagens celulares ou amostras de tecido, o papel de ALDH1A1 pode ser mais elucidado e as alterações fenotípicas como resultado da atividade elevada de ALDH1A1 podem ser investigadas.
| Linha celular | Tipo histológico | Fluorimetria (dobrar o ligar) | Confocal (% positivo) | Vazão (% positivo) | ||
| BG-1 | Adenocarcinoma pouco diferenciado | 1.12 | 3.2 | 4.9 | ||
| PEO4 | Cistoadenocarcinoma seroso de alto grau | 2.51 | 18.0 | 5.7 | ||
| OVCAR-3 | Adenocarcinoma seroso de alto grau | 10.25 | 39.8 | 7.6 | ||
| IGROV-1 | Adenocarcinoma endometrióide | 1.30 | 51.7 | 35.4 | ||
| Caov-3 | Adenocarcinoma seroso de alto grau | 1.72 | 93.7 | 70.1 | ||
Tabela 1: Resumo dos resultados de homogeneizados celulares, microscopia confocal e citometria de fluxo.
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Discussion
A pan-seletividade é uma limitação importante de muitas sondas ALDH; no entanto, vários exemplos de isoformas seletivas foram recentemente relatados 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. A sonda fluorogênica isoforme-seletiva utilizada neste estudo representa a primeira sonda racionalmente desenhada que reage apenas com a isoforma ALDH1A1, mesmo na presença de enzimas concorrentes que estão presentes em grandes quantidades em excesso11,12. Outra característica distintiva desta sonda é sua natureza fluorogênica única, que é caracterizada por baixa emissão de fluorescência antes da ativação da sonda. Isso contraria kits comerciais como o ensaio ALDEFLUOR, que apresenta um substrato fluorescente (BODIPY aminoacetaldeído [BAAA]) que está sempre em um "estado-on"32. O BAAA identifica células ALDH+ com base na premissa de que o produto carboxilato ativado (que é igualmente fluorescente) é retido em maior extensão nas células que expressam ALDH em níveis elevados. Para explicar o acúmulo inespecífico da sonda nas células ALDH-, um inibidor deve ser aplicado para bloquear ALDHs que estão presentes em uma amostra controle. No entanto, isso é acompanhado por várias desvantagens notáveis. Primeiro, se a intenção é identificar CSCs via atividade de ALDH1A1, a aplicação da estratégia inibidora falha porque também bloqueia outras isoformas em diferentes graus. Em segundo lugar, o comportamento inespecífico do inibidor pode prejudicar a capacidade de uma célula de desintoxicar aldeídos reativos em nível global. A primeira dessas preocupações é abordada no projeto do AlDeSense, pois ele só reage com uma única isoforma como mencionado acima (Figura Suplementar 1). Para amenizar a segunda preocupação, o Ctrl-AlDeSense substitui o papel do inibidor. Especificamente, o reagente de controle exibe um sinal fluorescente quase idêntico ao AlDeSense não ativado, é tomado em igual extensão pelas células e localiza-se predominantemente no citoplasma. Qualquer sinal além da linha de base estabelecida pelo controle deve, portanto, representar a ativação da sonda mediada por ALDH1A1.
Figura suplementar 1: A reatividade de AlDeSense e ALDEFLUOR. (A) Ativação de fluorescência normalizada do AlDeSense após incubação com cada isoforma de ALDH e (B) reatividade de ALDEFLUOR com cada isoforma de ALDH. Todas as medidas foram feitas em triplicata; barras de erro são ± SD. Clique aqui para baixar este arquivo.
A primeira aplicação da sonda fluorogênica isoforme-seletiva escolhida para destaque é a mensuração da atividade da ALDH1A1 em homogeneizados celulares. Em circunstâncias em que instrumentação especializada, como microscópios confocais ou citômetros de fluxo, não está disponível, o uso de fluorímetros comuns pode relatar rapidamente a atividade total de ALDH1A1 em uma amostra. Nessa linha, a facilidade de preparação da amostra (homogeneizados podem ser acessados a partir de amostras que variam de culturas de células a tecidos excisados) amplia a aplicabilidade deste ensaio. Existem alguns parâmetros-chave que devem ser considerados ao otimizar a sonda fluorogênica seletiva de isoformas para uso com homogeneizados. A primeira envolve a modulação do número de células por amostra de lisado. Por exemplo, se a faixa dinâmica, definida como a extensão da mudança do sinal fluorescente, não for suficientemente baixa, o número de células por amostra pode ser aumentado. Da mesma forma, o tempo de incubação também pode ser ajustado de tal forma que uma sonda mais fluorogênica possa ser ativada para produzir uma leitura fluorescente mais forte. No entanto, vale ressaltar que uma grande limitação deste método é a incapacidade de distinguir entre subpopulações de células exibindo níveis variados de atividade da ALDH1A1. Uma vez que as células são combinadas e lisadas independentemente de seu status ALDH1A1, a quantidade de atividade enzimática é calculada em média sobre todas as células presentes na amostra. Isso resulta em um desfecho diferente em comparação com as análises de microscopia confocal e citometria de fluxo, onde é a porcentagem de células ALDH+ que está sendo relatada. Enquanto as células BG-1 exibem a menor resposta de turn-on de dobra, bem como a menor população de células ALDH1A1+, a ordem das quatro linhagens celulares restantes torna-se inconsistente. Por exemplo, o ensaio de homogeneização identifica que as células OVCAR-3 têm a maior atividade global de ALDH1A1, enquanto ocupa apenas o terceiro lugar com base na microscopia confocal e na citometria de fluxo. Nossa interpretação desses dados é que uma célula ALDH1A1+ deve ter níveis variados de atividade. Por fim, é importante notar que esse tipo de experimento "liga-se" não seria possível usando sondas baseadas em acumulação.
Além disso, a sonda fluorogênica isoforme-seletiva é um agente de imagem molecular para a visualização de populações celulares de ALDH1A1+. É importante ressaltar que, embora a microscopia confocal tenha sido empregada nesta demonstração, essa sonda fluorogênica é compatível com uma grande variedade de configurações de imagem, incluindo contadores de células automatizados, microscópios de epifluorescência e instrumentos de iluminação de campo amplo. Um dos passos mais importantes neste experimento é o uso de Ctrl-AlDeSense para estabelecer os parâmetros de limiar apropriados (por exemplo, tamanho do orifício, potência do laser, ganho de FITC). Nesse sentido, as configurações devem ser ajustadas de forma que o sinal Ctrl-AlDeSense fique logo acima do plano de fundo. No caso de um usuário achar que é necessário aumentar a potência do laser para ver este sinal, recomenda-se estender o período de coloração do corante ou a concentração de carga em vez de aumentar a potência do laser (acima de 50%) devido ao aumento da fototoxicidade ou clareamento da sonda. Uma limitação da imagem confocal é a variabilidade ao combinar com Ctrl-AlDeSense. Apesar dessa ressalva, a ordem de linhagem celular observada com base em porcentagens crescentes de células ALDH1A1+ foi idêntica aos resultados obtidos por citometria de fluxo. Ao contrário da imagem molecular, onde o número máximo de células visualizadas é limitado pelo campo de visão, um experimento típico de citometria de fluxo analisa até dezenas de milhares de células. As considerações sobre tempo de coloração e concentração de carga são semelhantes àquelas discutidas para imagens moleculares. Um elemento adicional que deve ser considerado é mesmo a coloração de corante na suspensão celular para garantir que as populações de ALDH1A1+ falso-positivas não sejam identificadas erroneamente.
Para finalizar, este artigo destaca o processo de otimização do AlDeSense para uma variedade de modalidades, usando células cancerígenas de ovário como exemplo. Isso representa um primeiro passo importante para responder por que existem relatos contraditórios sobre a expressão de ALDH1A1 nesse tipo de câncer21,22,23,24. Além do que mostramos, imaginamos que essa sonda fluorogênica isoforme-seletiva pode ser usada em uma campanha de triagem de alto rendimento para identificar inibidores seletivos de ALDH1A1 que podem emergir como candidatos a drogas. Além disso, essa sonda pode continuar a ser usada para identificar CSCs em animais vivos, como demonstramos em nossa publicação inicial11. A característica emissiva da sonda fluorogênica seletiva de isoformas a prepara para experimentos de multiplexação, onde pode ser usada em conjunto com proteínas fluorescentes emissoras de vermelho, corantes de moléculas pequenas ou sondas responsivas ao analito. Além disso, existe uma versão vermelha da sonda fluorogênica seletiva para isoformas, o que pode expandir ainda mais essa capacidade de multiplexação12. Finalmente, na frente médica, essa sonda pode ser usada como uma ferramenta prognóstica no cenário clínico para a tomada de decisão de tratamento no ponto de atendimento. Quantificar a atividade de ALDH1A1 e populações de células ALDH1A1+ pode servir como um método para determinar a agressividade do câncer, permitindo estratégias de tratamento personalizadas para melhor qualidade de vida. Além disso, usando o AlDeSense, uma leitura pode ser entregue e interpretada em questão de horas.
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Disclosures
Divulgamos uma patente pendente (US20200199092A1) para a tecnologia AlDeSense.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (R35GM133581 para JC) e pelo Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (concedido à SG). JC agradece à Fundação Camille e Henry Dreyfus pelo apoio. Os autores agradecem ao Dr. Thomas E. Bearrood por sua contribuição inicial para preparar estoques de AlDeSense e AlDeSense AM. Agradecemos ao Sr. Oliver D. Pichardo Peguero e ao Sr. Joseph A. Forzano por sua assistência na preparação de vários precursores sintéticos. Agradecemos ao Prof. Erik Nelson (Departamento de Fisiologia Molecular e Integrativa, UIUC) pelas células Caov-3, IGROV-1 e PEO4. Agradecemos ao Prof. Paul Hergenrother (Departamento de Química, UIUC) pelas células BG-1. Agradecemos às instalações centrais do Carl R. Woese Institute for Genomic Biology pelo acesso ao microscópio confocal Zeiss LSM 700 e ao software correspondente. Agradecemos ao Flow Cytometry Facility pelo acesso ao BD LSR II CMtO Analyzer. Agradecemos à Dra. Sandra McMasters e ao Cell Media Facility pela assistência na preparação de meios de cultura celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
References
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