Summary
우리는 간단한 실험실 도구를 사용하여 Arabidopsis 및 Medicago의 루트 시스템 아키텍처 (RSA)를 검사합니다. 묘목은 메쉬 위에 수경 재배되고 아트 브러시를 사용하여 RSA를 드러냅니다. 스캐닝 또는 고해상도 카메라를 사용하여 이미지를 촬영한 다음 ImageJ로 분석하여 특성을 매핑합니다.
Abstract
식물 뿌리 시스템 아키텍처(RSA) 개발에 대한 포괄적인 지식은 영양소 사용 효율성을 개선하고 환경 문제에 대한 작물 재배 내성을 높이는 데 매우 중요합니다. 수경 재배 시스템, 묘목 성장, RSA 확산 및 이미징을 설정하기 위한 실험 프로토콜이 제시됩니다. 이 접근법은 폴리 카보네이트 쐐기로 지지되는 폴리프로필렌 메쉬를 포함하는 마젠타 상자 기반 수경 재배 시스템을 사용했습니다. 실험 설정은 다양한 영양소(인산염[Pi]) 공급 하에서 묘목의 RSA를 평가하여 예시됩니다. 이 시스템은 애기장대의 RSA를 조사하기 위해 설립되었지만 Medicago sativa (알팔파)와 같은 다른 식물을 연구하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다. 애기장대( Col-0) 묘목은 식물 RSA를 이해하기 위한 예로 이 조사에서 사용됩니다. 종자는 에탄올 및 희석된 상업용 표백제를 처리하여 표면 멸균하고, 성층화를 위해 4°C에서 보관한다. 종자는 발아되어 폴리 카보네이트 쐐기로 지지되는 폴리프로필렌 메쉬의 액체 하프 MS 배지에서 자랍니다. 묘목은 원하는 일 수 동안 표준 성장 조건에서 재배되고 메쉬에서 부드럽게 골라내어 물이 함유 된 한천 플레이트에 담근다. 묘목의 각 뿌리 계통은 둥근 아트 브러시를 사용하여 물이 채워진 판에 부드럽게 펼쳐집니다. 이 페트리 플레이트는 RSA 특성을 문서화하기 위해 고해상도로 촬영하거나 스캔합니다. 1차 뿌리, 측면 뿌리 및 분기 영역과 같은 뿌리 특성은 무료로 제공되는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다. 이 연구는 통제된 환경 환경에서 식물 뿌리 특성을 측정하는 기술을 제공합니다. (1) 묘목을 재배하고, 뿌리 샘플을 수집 및 퍼뜨리고, (2) 퍼진 RSA 샘플의 사진을 얻고, (3) 이미지를 캡처하고, (4) 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 뿌리 속성을 정량화하는 방법에 대해 논의합니다. 본 방법의 장점은 RSA 형질의 다양하고 쉽고 효율적인 측정입니다.
Introduction
지하에 있는 루트 시스템 아키텍처(RSA)는 식물 성장과 생산성 1,2,3을 위한 중요한 기관입니다. 배아 단계 후에 식물은 가장 중요한 형태 학적 변화를 겪습니다. 뿌리가 토양에서 자라는 방식은 땅 위의 식물 부분의 성장에 큰 영향을 미칩니다. 뿌리 성장은 발아의 첫 번째 단계입니다. 그것은 다른 이용 가능한 영양소 1,2,3,4에 독특하게 반응하기 때문에 유익한 특성입니다. RSA는 높은 수준의 발달 가소성을 나타내며, 이는 환경이 항상 개발 2,5에 대한 결정을 내리는 데 사용된다는 것을 의미합니다. 환경의 변화로 인해 현재 시나리오에서 작물 생산이 더욱 어려워졌습니다. RSA는 지속적으로 환경 신호를 개발 선택에 통합합니다5. 결과적으로 뿌리 발달의 원리에 대한 철저한 이해는 식물이 변화하는 환경에 어떻게 반응하는지 배우는 데 필수적입니다 2,5.
RSA는 다양한 영양소 농도를 감지하고 표현형 변화를 4,6,7,8,9,10,11,12로 만듭니다. 연구에 따르면 뿌리 형태/RSA는 싹 형태 1,3에 비해 매우 가소성이 높습니다. RSA 형질 맵핑은 주변 토양 환경 변화의 효과를 기록하는 데 매우 효과적이다 1,11,12.
일반적으로, 뿌리 표현형에 대한 다양한 영양소 결핍의 효과의 불일치는 많은 초기 연구에서 보고되었습니다 3,11,13,14,15. 예를 들어, 인산염(Pi) 기아로 인한 측근(LR)의 수, 길이 및 밀도 변화에 대한 몇 가지 대조적인 보고서가 있습니다. LR 밀도의 증가는 Pi 결핍 조건 6,8에서 보고되었습니다. 대조적으로, Pi 결핍 조건 하에서 LR 밀도의 감소는 다른 저자 3,13,16에 의해서도보고되었다. 이러한 불일치의 두드러진 원인 중 하나는 원소 오염이 발생하기 쉬운 겔화 배지를 사용하는 것인데, 한천에는 종종10개가 포함되어 있습니다. 연구원들은 일반적으로 한천 기반 플레이트 시스템에서 실험 식물을 재배하고 뿌리 특성을 기록합니다. 수많은 RSA 형질이 한천 물질 내에 숨겨져 있거나 굳어지는 경우가 많으며 문서화할 수 없습니다. 영양 결핍 유도와 관련된 실험은 사용자가 종종 배지에서 한 성분을 완전히 배제하는 것으로, 원소 오염이 발생하기 쉬운 겔화 배지11,14,15에서 수행할 수 없다. 수많은 영양소가 한천 배지에 상당한 양으로 존재하는 경우가 많으며, 여기에는 P, Zn, Fe 등이포함된다 11,14,15. 또한, RSA 성장은 한천 기반이 아닌 액체 배지보다 한천 기반 배지에서 더 느립니다. 그 결과, RSA의 표현형을 정량화하고 정성적으로 기록하기 위한 대안적인 비한천 기반 접근법을 확립할 필요가 있다. 결과적으로, 폴리카보네이트 쐐기 1,10,11에 의해 지지되는 폴리프로필렌 메쉬 위에 자홍색 상자 기반 수경재배 시스템에서 묘목을 키우는 현재의 방법이 개발되었습니다.
이 연구는 Jain et al.10에 의해 기술된 이전 방법의 상세한 즉석 버전을 제시한다. 이 전략은 식물 뿌리 생물학의 현재 요구에 맞게 조정되었으며 모델 식물 이외의 알팔파와 같은 식물에도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RSA의 변경 사항을 측정하는 주요 방법이며 간단한 장비만 있으면 됩니다. 본 프로토콜은 정상 및 변형된 배지(Pi 결핍)에서 1차 및 외측 뿌리와 같은 여러 뿌리 특징을 표현형화하는 방법을 보여줍니다. 저자의 경험에서 얻은 단계별 지침과 기타 유용한 힌트는 연구자들이 이 방법에서 제공되는 방법론을 따르는 데 도움이 되도록 제공됩니다. 본 연구는 고차 LR을 포함하여 식물의 전체 뿌리 시스템을 밝히기 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 둥근 수채화 아트 브러시로 루트 시스템을 수동으로 펼치면 루트 1,10,11,12의 노출을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 고가의 장비나 복잡한 소프트웨어가 필요하지 않습니다. 이 방법은 영양소 흡수와 성장률을 향상시켰습니다. 식물은 뿌리에 쉽게 흡수되는 영양이 풍부한 용액을 가지고 있습니다. 본 방법은 특히 초기 발달 (발아 후 10-15 일) 동안 식물의 뿌리 시스템의 특성을 자세히 매핑하고자하는 연구자에게 적합합니다. 작은 뿌리 시스템, 애기장대 및 담배와 같은 모델 식물, 뿌리 시스템이 자홍색 상자에 들어갈 때까지 알팔파와 같은 비전통적인 식물에 적합합니다.
애기장대에서 RSA 발달의 표현형 분석 단계는 다음과 같이 이 프로토콜에 요약되어 있습니다: (1) 식물(Arabidopsis)에 대한 종자 표면 살균 방법, (2) 수경 재배 시스템을 설정하는 단계, 배지에 종자 파종, (3) RSA 분석을 위해 완전한 파종을 꺼내 페트리 플레이트에 뿌리는 절차, (4) RSA용 이미지를 기록하는 방법, (5) ImageJ 소프트웨어를 사용하여 중요한 RSA 매개변수를 계산합니다.
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Protocol
전체 프로토콜은 그림 1에 개략적으로 요약되어 있으며, 묘목의 뿌리 시스템 아키텍처 (RSA)를 밝히는 데 관련된 모든 필수 단계를 보여줍니다. 프로토콜 단계는 아래에 자세히 나와 있습니다.
1. 애기장대 종자 표면 살균
- 작은 스쿱(약 100개의 씨앗 = 약 2.5mg)의 씨앗을 미세분리기 튜브에 옮기고 실온(RT)에서 증류수에 30분 동안 담급니다. 이 모든 절차는 무균 상태에서 수행됩니다.
- RT에서 탁상용 원심분리기를 사용하여 종자가 들어 있는 미세분리기 튜브를 5초 동안 5 초 동안 잠시 원심분리합니다.
- 물을 디캔팅하고 70%(v/v) 에탄올 700μL를 넣고 몇 초 동안 소용돌이치고 회전합니다. 필요한 경우 와동 및 회전을 반복하되 70% 에탄올의 처리 시간이 3분으로 유지되도록 합니다.
- 3분 후 즉시 멸균수로 한 번 헹굽니다. 장기간 에탄올 노출은 발아를 감소시키므로 에탄올 세척 단계를 가능한 한 시기 적절하게 유지하십시오.
- 희석된 상업용 표백제(4% v/v)로 씨앗을 Tween-20 한 방울과 함께 7분 동안 처리합니다. 튜브를 빠르게 8-12회 뒤집어 씨앗을 표백제 용액과 혼합한 다음 간단한 원심분리기(RT에서 5초 동안 500 x g )를 가합니다. 튜브에 거품이 나타나는 것이 보입니다.
- 1mL 피펫을 사용하여 상청액을 디캔팅하고 동일한 와류 절차에 따라 멸균수로 최소 5회 세척하여 종자를 헹굽니다.
- 표면 멸균된 종자를 물에 그대로 두고 성층화를 위해 4°C에서 2-3일 동안 배양한다10.
2. 종자 발아를 위한 수경재배 시스템 설정
- 표준 마젠타 상자에 증류수를 반쯤 채우고 오토클레이브합니다. 폴리카보네이트 시트(선명한 색상과 부드러운 질감)를 오토클레이브하고 4cm x 8cm 직사각형을 절단하고 두 개의 직사각형이 함께 슬롯되어 X 모양10을 형성할 수 있도록 직사각형의 중간 지점이 중간 이상 노치가 있습니다. 이 설정을 사용하여 12x 24인치 시트(10)에서 자른 폴리프로필렌 메쉬(250μm 기공 크기의 6cm x 6cm 정사각형 또는 요구 사항에 따라 다름)를 고정합니다.
알림: 폴리프로필렌은 산, 알칼리 및 기타 화학 물질에 대한 내성이 강합니다. 따라서 선택되었습니다. 오토클레이빙은 폴리프로필렌 메쉬를 왜곡시키는 경향이 있습니다. 따라서 알루미늄 호일로 별도로 싸서 휴대하는 것이 좋습니다. 16분, 121°C, 15psi 또는 775mmHg의 일반적인 오토클레이빙 조건이 권장됩니다. - Shukla et al.1에 의해 기술된 바와 같이, 비타민 + 1.5%(w/v) 자당이 함유된 멸균 하프 MS 기초 배지를 각 박스에 추가하여 층류에서 폴리프로필렌 메쉬의 하단 가장자리에 도달합니다. 모든 절차는 무균 상태에서 수행됩니다.
- 표면 멸균 된 씨앗을 메쉬 (250 μm 기공 크기)에 수경 재배로 뿌리고 3 일 동안 자랄 수 있도록합니다.
- 3 일 후, 묘목을 메쉬 (500 μm 기공 크기)로 옮기고 2 일 동안 자랄 수 있도록합니다.
- 2일 후(총 5일) 후, 묘목을 대조군 배지(즉, 2.0mMNH4NO3, 1.9mMKNO3, 0.15mMMgSO4·7H2O, 0.1mMMnSO4· H2O, 3.0 μM ZnSO4·7H2O, 0.1 μM CuSO4·5H2O, 0.3 mM CaCl2·2H2O, 5.0 μM KI, 0.1 μMCoCl2·6H2O, 0.1 mM FeSO4·7H2O, 0.1 mM Na2EDTA·2H2O, 1.25mM KH2PO4, 100 μM H3BO3, 1 μM Na2MoO4·2H2O,1.5% 수크로오스, 1.25 mM MES, pH 5.7 0.1 M MES[pH 6.1]로 조정하고, 실험 배지(예를 들어, P-[0 mM]로 처리; KH2PO4는 상기언급된 바와 같은 대조 배지 조성으로부터 0.62 mMK2SO4로 대체된다 1. 과잉 Pi 처리의 경우, 변형된 MS 배지[2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mM]1)에서KH2PO4의 농도를 증가시키고, 종자를 7일 동안 성장시킨다.
알림: 더 큰 메쉬 기공 크기(500μm)는 배축을 손상시키거나 절단할 필요 없이 전체 묘목을 부드럽게 따는 것을 용이하게 합니다. 묘목은 23°C에서 표준 성장 조건(즉, 16시간 밝음/8시간 어두운 광주기, 150μmol·m-2·s-1 광도, 60%- 70% 습도)에서 자랍니다.
3. RSA 심사
- 뿌리 살포를 위해 한천 (1.1 %) 플레이트를 준비합니다 (페트리 플레이트 크기 : 150 mm x 15 mm).
- 위에서 언급 한대로 10-20 mL의 고압 증기 멸균 여과 수돗물을 페트리 플레이트에 첨가하십시오. 메쉬 (500 μm)에서 묘목을 부드럽게 꺼내 접시의 물에 담그십시오.
- 둥근 수채화 아트 브러시(크기: 14번, 16번, 18번, 20번)를 사용하여 물이 채워진 접시에 각 묘목의 뿌리를 부드럽게 펼칩니다.
알림: 루트 시스템의 퍼짐을 수행하는 동안 먼저 기본 루트를 잡고 축 역할을 하므로 직선으로 퍼뜨립니다. 그런 다음 가능한 한 LR을 기본 루트의 양쪽에 대칭으로 퍼뜨립니다. 그 후, 1차 LR에 연결된 2차 LR을 스프레드합니다. 이 확산 과정은 일종의 예술입니다. RSA의 이미지를 그리는 아티스트처럼 부드럽게, 천천히하십시오. - 접시를 약간 기울여 물기를 제거합니다.
알림: 이 시점에서 이 확산판을 4°C에 두어 절차를 일시 중지할 수 있습니다. 나중에 이미지 처리가 필요할 때 플레이트를 꺼내 잠시 동안 RT에 두십시오. 응축수를 닦아내면 이미지를 편리하게 처리할 수 있습니다.
4. RSA용 이미지 녹화
- 이 페트리 플레이트를 적절하게 스캔하거나 사진을 찍으십시오.
참고: 고품질 사진을 얻으려면 스캔에는 600dpi 해상도를, 사진 촬영에는 최소 12메가픽셀 카메라를 사용하는 것이 좋습니다. - 무료로 사용할 수 있는 ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 루트 시스템 아키텍처 특성을 측정합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 치근 길이를 측정하는 단계를 빠르게 따르려면 "DNA 윤곽 길이 측정"17 예제를 참조하십시오.
참고: 이 단계는 고해상도 스캐너 또는 카메라를 사용하여 캡처한 사진의 루트 길이를 측정하기 위해 수행됩니다.- 주어진 길이의 거리를 사용하여 축척을 설정합니다. 그림 3 에서 눈금 막대의 알려진 거리는 2cm입니다. ImageJ 도구 모음에서 [ 직선 도구](왼쪽에서 다섯 번째 도구)를 선택합니다. 직선 도구를 사용하여 축척 막대의 윤곽선을 그리는 선 선택 영역을 만듭니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하거나, 두 번 클릭하거나, 시작 부분의 상자를 클릭하여 개요를 마칩니다.
- 측정값 분석 도구 모음을 사용하여 알려진 축척 막대의 길이를 픽셀 단위로 측정>. 픽셀 길이를 기록해 둡니다.
- 분석(Analyze) 탭에서 배율 설정(Set Scale) 탭을 클릭하여 배율 설정(Set Scale) 대화상자를 엽니다. Distance in Pixels 필드에 픽셀 길이를 입력합니다(위에서 언급한 대로). 그런 다음 알려진 거리 필드에 축척 막대로 표시된 대로 값을 입력합니다(여기서는 20mm). 길이 단위를 mm로 설정합니다. 픽셀 종횡비는 1.0입니다. 이제 스케일은 밀리미터당 x 픽셀 수로 지정됩니다. 이 특정 이미지의 배율을 잠그려면 확인을 클릭합니다.
- 세그먼트 선 도구를 사용하여 루트 길이의 윤곽선을 그리는 선 선택을 만듭니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하거나, 두 번 클릭하거나, 시작 부분의 상자를 클릭하여 개요를 마칩니다. 윤곽선을 따라 작은 흑백 "핸들"을 클릭하고 드래그하여 필요에 따라 선 선택을 조정합니다.
- ImageJ의 분석 탭 아래에 있는 측정 명령을 사용하여 루트의 길이를 수량화합니다. 측정된 데이터를 스프레드시트로 전송하려면 결과 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 모두 복사를 선택한 다음 스프레드시트로 전환한 다음 데이터를 붙여넣습니다.
참고: 위에서 설명한 대로 ImageJ 배율 설정 옵션에서 배율 막대의 알려진 거리를 사용하여 배율을 설정합니다. 이것은 단위 길이당 픽셀 수를 제공합니다. 새로운 이미지를 분석할 때마다 매번 스케일을 새로 설정해야 합니다.
- RSA 특성의 측정 및 계산
- 배축 접합부와 뿌리 끝 사이의 기본 뿌리 길이를 측정합니다.
- 1차 및 2차 LR 길이를 측정합니다.
- 1차 루트의 분기 영역(BZ)을 측정합니다. 기본 루트(BZPR)의 분기 영역은 첫 번째 LR 신흥 지점부터 마지막 LR 신흥 지점까지 걸쳐 있습니다.
- BZPR의 경계 내에서 발생하는 LR의 수인 LR 수를 기록합니다.
- 1차 LR과 상위 LR의 평균 길이를 측정합니다. 1° LR의 총 길이를 1° LR의 총 수로 나누어 1차 LR(1° LR)(루트당 센티미터)의 평균 길이를 도출합니다.
- 2차 LR의 평균 길이를 측정합니다. 2° LR의 총 길이를 2° LR의 총 수로 나누어 2차 LR(2° LR)의 평균 길이를 계산합니다.
- 1° LR 밀도를 측정합니다. 1° LR의 수를 BZPR의 길이로 나누어 1° LR 밀도(BZPR의 단위 길이당 1° LR 수)를 계산합니다.
- 2° LR 밀도를 측정합니다. 2° LR의 수를 1° LR의 BZ 길이로 나누어 2° LR 밀도를 계산합니다(BZ의 단위 길이당 2° LR 수 1° 측근).
- 총 루트 길이(TRL)를 측정합니다. 이것은 기본 루트, 1° LR 및 2° LR(있는 경우 그 이상) 길이의 집합입니다.
5. 뿌리털 측정
참고: 수경재배 시스템은 뿌리털 성장과 발달을 촉진하는 데 좋지 않지만 고체 성장 배지만큼 견고함에도 불구하고 현재 맥락에서 연구하는 것이 여전히 중요합니다. 아래 단계에 따라 묘목의 기본 뿌리 끝에서 5mm 섹션의 뿌리털 발달을 분석하십시오.
- 뿌리 끝에서 기본 뿌리의 2cm 부분을 잘라냅니다.
- 10% 글리세롤을 장착 매체로 사용하여 슬라이드에 루트 섹션을 장착합니다.
- 슬라이드를 실체 현미경 아래에 놓습니다.
- 축 방향 캐리어를 사용하여 뿌리털의 이미지를 시각화하고 캡처합니다.
- 앞에서 설명한 대로 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하여 뿌리털의 구조와 특성을 연구합니다.
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Representative Results
루트 시스템 아키텍처(RSA)의 다양한 형태학적 특성은 간단한 실험실 도구를 사용하여 측정되며 단계는 그림 1에 개략적으로 설명되어 있습니다. 수경 재배 설정의 세부 사항은 RSA를 측정할 때 프로토콜의 잠재력을 보여줍니다(그림 1 및 그림 2).
겔화제에서 관찰된 차이를 감안할 때, 우리는 모든 연구를 수행하기 위해 수경재배 시스템을 사용하였다 3,10. 개념 증명으로, 이 수경 재배 시스템은 Pi 결핍 및 충분한 조건에서 명백한 대조 표현형을 반영하여 잘 작동합니다(그림 3). 애기장대 종자는 그림 2에 예시된 바와 같이 폴리프로필렌 메쉬 상의 half-MS 배지에서 5일 동안 수경재배되었습니다. 묘목은 5일 후에 Pi가 결핍되고 충분한 조건으로 이식되어 7일 동안 자랄 수 있도록 했습니다(그림 3).
다양한 영양소(Pi) 공급에 따른 RSA 특성 입증
우리는 RSA3의 특성을 분석하고 기록하기 위해 확립된 계획을 따랐습니다. 수경 재배 조건에서 대조되는 Pi 체계 하에서 서로 다른 RSA 형질을 분석했습니다(그림 3). Pi 결핍 처리(0mM Pi)는 Pi 충분 조건에 비해 더 짧고, 더 얕고, 더 적은 분지형 RSA를 나타내는 일반적으로 보고된 뿌리 표현형을 불러일으켰습니다(그림 3A). 1차 뿌리 길이는 Pi 결핍 조건에서 상당히 약화되었습니다(그림 3A,B). Pi(1.25mM)의 존재 하에서 빠르게 얻어진 1차 뿌리 길이는 생리학적 변화를 적절하게 반영하는 수경 재배 시스템의 효율성을 보여줍니다(그림 3A,B). TRL은 Pi 결핍 조건에서 유의하게 감소했습니다(그림 3B). 도 3A에 나타낸 바와 같이, 분지 영역(BZPR)은 Pi 결핍 조건 하에서 상당히 감쇠되었다(도 3B).
이러한 특성 중 가장 큰 영향을 받은 것은 TRL이었는데, 이는 두 Pi 조건 간의 LR 수 차이가 높기 때문입니다. Pi 충분 조건(1.25mM)에서 RSA의 활발한 성장은 1° LR의 수와 길이의 상당한 증가로 인한 것입니다. 따라서 주로 LR 개발의 변경으로 인해 급격한 RSA 변화가 발생했습니다. 우리는 1 차 뿌리의 분기 영역 경계 내에서 발생하는 LR의 수를 측정했는데, 이는 1,3,18이더 의미있는 것으로 간주되기 때문입니다. 1° LR(뿌리당 센티미터)의 평균 길이는 Pi 결핍 조건에서 유의하게 감소했습니다(그림 3C). 평균 2° LR 길이는 P0 조건으로 인해 유사하게 감소되었습니다. 그러나 평균 1° LR 길이보다 양이 적었습니다(그림 3C). 1° LR 및 2° LR의 수는 P1.25 조건과 비교하여 P0 조건에서 크게 감소했습니다(그림 3D). 1° LR 밀도(BZPR 길이의 센티미터당 1° LR 수)는 P1.25 조건에 비해 P0 조건에서 변경되지 않았습니다(그림 3E). 2° LR 밀도(1° LR의 BZ 센티미터당 2° LR 수)도 큰 변화를 나타내지 않았습니다(그림 3E). 따라서 LR의 밀도를 결정하는 것은 RSA 가소성에 대한 유용한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다.
다양한 인산염(Pi) 체계 하에서 뿌리털 발달 분석
모종의 일차 뿌리에서 Pi 공급이 뿌리털 발달에 미치는 영향을 연구했습니다. 뿌리털 길이는 Pi의 농도가 증가함에 따라 최대 2.5mM까지 증가했지만 5mM 및 10mM에서 감소하는 것으로 나타났습니다. 그러나 20mM에서 뿌리털 길이는 거의 최고 수준으로 돌아왔습니다(보충 그림 1). 뿌리털의 수는 다른 모든 Pi 공급품에 비해 0mM에서 유의하게 더 높았으며 20mM에서 가장 높은 수가 관찰되었습니다(보충 그림 1).
애기장대 이외의 식물에 대한 본 방법의 적용
우리는 Medicago sativa (알팔파)를 시험 식물로 사용하여 애기장대 이외의 식물에 대한 본 방법의 타당성을 조사했습니다. 프로토콜은 (1) 종자 표면 살균 방법 및 (2) 폴리프로필렌 메쉬의 기공 크기(현재 1,000μm 더 큼)의 두 가지 측면의 요구 사항에 따라 수정되었습니다. 표면 종자 살균 및 층화 프로토콜은 연구할 선택한 식물에 따라 항상 최적화되어야 합니다. 알팔파의 경우 Weeks et al.19에 설명된 대로 단계를 따랐습니다. 표면 멸균 후, 종자를 성층화를 위해 4°C에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 우리는 메쉬 공극 크기의 수정과 함께 이 프로토콜에 설명된 것과 동일한 절차를 따랐습니다. 그림 4A, B에서 볼 수 있듯이 묘목은 다양한 Pi 공급량에서 변경된 RSA와 함께 잘 자랐습니다. 그림 4C 는 Pi 영양 용액의 1.25, 0 및 20mM 하에서 뿌리 시스템 가소성을 표시합니다. 과잉 Pi(20mM) 및 불충분한 Pi 공급은 Pi 충분한(1.25mM) 조건(대조군)과 비교하여 루트 시스템의 발달을 감소시켰습니다(그림 4C). RSA는 프로토콜에 설명된 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 다양한 특성에 대해 매핑할 수 있습니다. 따라서 프로토콜은 간단하고 효율적이며 선택한 식물 종에 따라 쉽게 수정할 수 있습니다. 다양한 영양 조건에서 다양한 식물 종의 RSA를 연구할 수 있는 기회를 제공합니다.
그림 1: 절차의 개략도. 회로도는 RSA를 매핑하기 위한 방법 프로토콜과 관련된 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 묘목을 재배하기 위한 자홍색 상자에 수경 재배 설정 표시 . (Jain et al.10에 의해 기술된 바와 같이, 수정됨). (A) 설정을 조립하기 위한 폴리카보네이트 웨지 노치가 있는 두 개의 직사각형 조각(4cm x 8cm). (B) 메쉬 표면을 지지하기 위해 X자 모양으로 변하는 노치를 통해 폴리카보네이트 쐐기를 서로 조립합니다. (C) 250μm 폴리프로필렌 메쉬 시트(6cm x 6cm). (D) 마젠타 상자에 있는 폴리카보네이트 쐐기 조립의 평면도. (E) 매체로 채워진 마젠타색 상자의 폴리카보네이트 쐐기 상의 폴리프로필렌 메쉬 조립. (F) 그물망에서 발아한 애기장대 묘목의 전시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이 표현형 분석법을 사용하여 다양한 영양소 조건(Pi 결핍[0mM] 및 충분[1.25mM])에서 일반적인 RSA 변조를 시연합니다. 애기장대(Col-0) 묘목은 그림 2와 같이 0.5x MS 배지에서 5일 동안 수경재배한 후, Pi 결핍 및 충분한 공급(각각 0 및 1.25mM)을 거쳐 7일 동안 성장시켰다. (A) 개별 묘목을 폴리 프로필렌 메쉬 (500 μm)에서 꺼내어 둥근 아트 브러시와 물을 사용하여 한천 페트리 플레이트에 뿌립니다. RSA 특성의 데이터는 (B) 1차 근(PR) 길이, 총 근 길이(TRL), 분기 영역(BZ), (C) 평균(Av.) 1차 측근 길이(1° LR 길이), 평균(Av.) 2차 외측 루트 길이(2° LR 길이), (D) 1° LR 및 2° LR 수, (E) 1° LR 및 2° LR 밀도. 값은 SE± 평균입니다. n = 21입니다. 이 수치는 Shukla et al.1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 애기장대 이외의 다른 식물에 이 방법을 적용할 수 있음을 보여주기 위한 예로서 Medicago sativa(알팔파) 뿌리 시스템의 시연. (A) 알팔파 묘목의 성장을 보여주는 자홍색 상자의 측면도. (B) 마젠타색 상자의 평면도는 폴리프로필렌 메쉬(기공 크기 1,000μm)에서 싹의 출현을 보여줍니다. (C) 이 RSA 표현형 방법을 사용하여 다양한 영양 조건(Pi 결핍[0mM], 과잉 Pi[20mM] 및 충분 또는 대조군[1.25mM])에서 알팔파 조절의 일반적인 뿌리 시스템 아키텍처(RSA). 알팔파 묘목은 5일 동안 0.5x MS 배지에서 수경재배하고, Pi 결핍, 충분 및 과잉 공급(각각 0, 1.25 및 20mM)을 받고, 7일 동안 성장합니다. 개별 묘목은 폴리 프로필렌 메쉬 (1,000 μm)에서 꺼내어 아트 브러시와 물을 사용하여 C와 같이 한천 페트리 플레이트에 뿌립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 다른 과잉 Pi 농도는 뿌리털 발달을 조절합니다. WT 묘목은 프로토콜에 설명된 대로 수경법으로 재배되었습니다. (A) 일차 뿌리의 끝에서 1-2cm 부분을 잘게 썰어 10% 글리세롤이 함유된 슬라이드에 장착하고 끝에서 5mm 영역을 뿌리털 수와 길이에 대해 기록했습니다. 데이터는 (B) 근모 길이 및 (C) 일차 치근 끝의 5mm 영역에 있는 근털 수에 대한 것입니다. 값은 SE± 평균입니다. n = 10 (B 및 C). 알파 문자가 다른 막대는 스튜던트 쌍체 t-검정에 따라 유의하게 다릅니다(p ≤ 0.05). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작업에서는 간단한 실험실 장비를 사용하여 RSA를 매핑하는 방법을 시연했습니다. 이 방법을 사용하면 표현형 변경이 정제 된 수준에서 기록됩니다. 이 전략의 이점은 싹 부분이 미디어와 접촉하지 않기 때문에 묘목의 표현형이 독창적이라는 것입니다. 이 방법은 프로토콜에 설명 된대로 묘목을 재배하기 위해 수경 재배 시스템을 설정하는 것을 포함합니다. 그런 다음 각 묘목을 그대로 꺼내 한천으로 채워진 페트리 플레이트에 놓습니다. 그런 다음 루트 시스템을 아트 브러시를 사용하여 수동으로 퍼뜨리고 ImageJ 소프트웨어 1,10,11,12로 사진을 촬영하여 분석합니다.
종자 발아는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스를 제거하기 위해 종자 표면 살균이 필요합니다. 알코올 - 70 % 에탄올 - 종자 표면을 살균하는 데 사용됩니다. 씨앗을 파괴하지 않고 소독하려면 알코올 살균 치료 시간을주의 깊게 따라야합니다. 종자 발아는 알코올 살균이 과도해질 때 감소합니다. 치료 시기는 식물 종에 따라 다릅니다(예: 애기장대의 경우 시간 제한은 3분 1,10,11,12,20인 반면 Medicago sativa의 경우 5분 19입니다. 분석을 위해 RSA를 원활하게 따기 위해서는 1,10,11,12 사이의 루트 시스템의 얽힘을 방지하기 위해 메쉬 또는 마젠타 상자 당 씨앗 수를 제한하는 것이 중요합니다. 이것은 메쉬당 더 적은 수의 시드를 사용하여 달성할 수 있습니다. 예를 들어, 메쉬당 4개의 시드를 사용하면 얽힘의 위험을 줄이는 동시에 루트 시스템의 강력한 성장과 개발을 허용하는 데 도움이 될 수 있습니다. 메쉬 당 최적의 종자 수는 특정 식물 종과 RSA 분석의 목표에 따라 다릅니다. 예를 들어, 실험에 RNA 분리와 같은 추가 다운스트림 처리 요구 사항을 위해 조직이 필요한 경우 대량 파종이 권장됩니다(애기장대의 경우 메쉬당 100개의 종자)1,10,11,12. 메쉬에서 묘목을 따는 것은 최대한의주의와주의가 필요한 섬세한 과정입니다 1,10,11. 섬세한 묘목이 손상되지 않도록 이 작업에 천천히, 부드럽게, 신중하게 접근하는 것이 중요합니다. 그물망에서 묘목을 골라내려면 가는 핀셋이나 집게를 사용하여 묘목을 부드럽지만 단단하게 잡는 것이 좋습니다. 묘목은 뿌리 시스템을 방해하거나 묘목에 손상을 입히지 않도록 메쉬에서 조심스럽게 들어 올려야 합니다. 인내심을 갖고 시간을 내어 메쉬에서 각 묘목을 조심스럽게 제거하여 공정 중에 손상되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 실험의 성공을 보장하기 위해 천천히, 부드럽게, 신중하게 수행해야하는 점진적인 과정입니다. 묘목의 RSA를 정확하게 측정하기 위해서는 정확한 측정이 가능하도록 페트리 플레이트에 눈금을 표시하는 것이 중요합니다 1,10,11. 이것은 영구 마커를 사용하여 1cm 또는 2cm와 같은 알려진 거리에서 페트리 플레이트에 선을 그려서 수행할 수 있습니다. 저울은 페트리 플레이트의 가장자리를 따라 눈에 잘 띄는 위치에 놓아야 합니다. 브러시를 사용하여 RSA를 퍼뜨릴 때 각별한 주의를 기울이는 것도 중요합니다. 1차 뿌리는 페트리 플레이트의 중앙에 조심스럽게 위치해야 하며 측면 뿌리는 1차 뿌리의 양쪽에 펼쳐져 있어야 합니다. 뿌리 시스템은 확산을 촉진하기 위해 부분적으로 물에 잠겨 있어야합니다. 각각의 새로운 페트리 플레이트를 측정하려면 매번 ImageJ 소프트웨어에서 스케일을 설정해야 합니다.
RSA 분석의 효율성, 비침습성 및 효과를 개선하기 위해 사용할 수 있는 수정 사항은 거의 없습니다1. 그러한 개선 사항 중 하나는 묘목을 고정하는 데 사용되는 폴리 프로필렌 메쉬의 기공 크기를 변경하는 것입니다. 메쉬의 기공 크기는 연구되는 식물 종의 특정 요구에 적합하고 뿌리 시스템 1,10,11,12의 성장 및 발달을 최적화하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 더 큰 메쉬 기공 크기 (500 μm)는 이전에10,11,12 번 실시 된 배축을 자르지 않고 전체 묘목을 부드럽게 따는 것을 용이하게합니다. 또한, 더 큰 공극 크기는 더 큰 식물 종 RSA에 더 적합할 수 있는 반면, 더 작은 공극 크기는 더 작은 식물 종에 더 적합할 수 있다. 할 수 있는 또 다른 수정은 폴리프로필렌 메쉬를 알루미늄 호일로 감싸서 구부러지는 것을 방지하는 것입니다. 이것은 메쉬의 모양과 무결성을 유지하는 데 도움이 될 수 있으므로 평평한 바닥 매트릭스 역할을 하기에 적합합니다. 이러한 수정 사항 외에도 다른 문제 해결 기술을 사용하여 RSA 분석 중에 발생할 수 있는 문제를 해결할 수 있습니다. 예를 들어, 묘목이 예상대로 자라거나 발달하지 않으면 온도, 습도 및 조명 수준과 같은 환경 조건을 조정해야 할 수 있습니다. 루트 시스템이 얽혀 있으면 위에서 언급 한 것처럼 메쉬 당 시드 수를 줄여야 할 수 있습니다.
RSA 분석의 주요 장점 중 하나는 한천 없이도 식물 뿌리 시스템을 연구 할 수 있다는 것입니다. 한천은 일반적으로 식물 조직 배양 및 종자 발아 실험에서 응고제로 사용됩니다. 그러나, 한천을 사용하면, 잠재적으로 인공물을 생성하고 결과의 정확도에 영향을 줄 수 있는 원소 오염이 발생할 수 있다10. 한천에 대한 요구 사항을 제외함으로써 RSA 분석은 한천 유래 원소 오염의 위험과 인공물의 가능성을 제거합니다. 따라서 RSA 분석은 식물 뿌리 시스템 1,3,10,11,12를 연구하는 데 있어 보다 신뢰할 수 있고 정확한 방법입니다. 예를 들어, Pi 박탈이 측면 치근 밀도에 미치는 영향은 여러 모순된 보고서의 주제였습니다. Pi가 낮을 때 LR 밀도가 증가하는 것으로 보고되었습니다 6,8. 대조적으로, 측면 뿌리 밀도의 감소는 Pi 결핍 조건 3,13,16에서도 발견되었습니다. 이러한 불일치는 작업자가 다양한 브랜드의 한천을 사용하여 다양한 정도의 파이 오염10을 가진 배지를 젤리화하는 한천 기반 성장 배지 시스템에 기인할 수 있습니다. 다시 말하지만, 한천 기반 겔화 배지가 Zn 오염을 포함하기 때문에 RSA에 대한 Zn 결핍의 효과를 설명하기 위한 실험은 한천 기반 페트리 플레이트 방법을 사용하여 적절하게 수행되지 않을 수 있습니다(11). 따라서 RSA 분석을 수행하는 것은 한천 기반 겔화 배지를 사용하여 영양소 결핍을 조사하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 둘째, 한천 기반 겔화 배지에서 자란 묘목은 수경 재배만큼 빨리 발달하지 않습니다. 셋째, RSA는 일반적으로 한천 배지에 내장되어 있기 때문에 수많은 루트 기능이 올바르게 표시되지 않습니다. 넷째, 매체에서 RSA를 제거하면 종종 RSA에 상당한 손상을 입히고 파괴적인 샘플링 기술이 됩니다.
Jain et al.10에 의해 발표 된 이전의 수경 재배 기술은 250 μm의 폴리 프로필렌 메쉬 크기를 사용했는데, 이는 온전한 RSA를 빼낼 수없는 더 좁은 기공을 가졌다. 그 결과, 그 특별한 경우에 우리는 RSA를 분리하기 위해 배축 영역에서 묘목을 잘라내어 파괴적인 샘플링 방법10,11,12로 바꿔야 했습니다. 기존 방법은 RSA500에 손상을 입히지 않고 전체 애기장대 묘목을 온전하게 꺼낼 수 있는 더 큰 기공 크기(1μm)의 폴리프로필렌 메쉬를 사용하여 비파괴적으로 전환하도록 즉석에서 만들어졌습니다. 묘목의 유형에 따라 폴리 프로필렌 메쉬의 기공 크기를 항상 조정할 수 있다는 점에 유의해야합니다. 예를 들어, 그림 4는 Medicago sativa(알팔파)와 같은 다른 식물의 RSA를 매핑하는 데 유사한 접근 방식을 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 우리는 Medicago 뿌리 시스템을 수용하기 위해 1mm의 폴리프로필렌 기공 크기를 선택했습니다.
이 시스템의 한 가지 단점은 한천 플레이트 시스템에 비해 수경 재배 시스템에서 번성하지 않는 뿌리털의 발달일 수 있습니다. 주요 원인은 고체 매체가 아닌 액체 매체에서 영양소를 쉽게 이용할 수 있기 때문입니다. 비록 우리가 동일한 시스템을 사용하여 뿌리털의 발달(튼튼하지 않음)을 관찰하고 결과를 얻었음에도 불구하고(보충 그림 1). Pi의 가용성은 모근 발달에 큰 영향을 미칩니다10,11. 여기서, 뿌리털 길이는 초기에 2.5mM까지 증가하다가 감소하였다.
전체적으로, 시스템의 주요 장점은 다음과 같습니다 : (1) 정교한 고급 장비가 필요없는 간단하고 정확한 방법입니다. (2) 이 방법은 수경 재배 특성으로 인해 묘목의 빠른 성장을 허용합니다. (3) 비파괴적인 방법입니다. (4) RSA의 수동 확산을 통해 각 특성을 적절하게 표시하고 숨겨진 RSA를 드러내며 사용자에게 완전한 제어를 제공합니다. (5) 이 방법은 또한 사용하기 쉬운 자유롭게 이용 가능한 이미징 소프트웨어(즉, ImageJ)를 사용한다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구를 지원해 주신 미국 농무부(보조금 58-6406-1-017)에 감사드립니다. 우리는 또한 미국 켄터키주 볼링 그린에 있는 Western Kentucky University의 WKU 생명공학 센터와 기기 시설 및 지원을 제공한 인도 러크나우에 있는 CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants의 소장에게 감사드립니다(CSIR CIMAP 원고 통신 번호 CIMAP/PUB/2022/103). SS는 미국 필라델피아에 있는 Saint Joseph's University의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
