Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لاختبار تجنب المكان النشط ، وهو نموذج تعلم مكاني يعتمد على الحصين مصمم للقوارض. يسمح تغيير المعلمات الرئيسية بإعادة اختبار قبل وبعد العلاج أو بمرور الوقت.
Abstract
تم اختبار التعلم المكاني المعتمد على الحصين في القوارض باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. وتشمل هذه المهام متاهة موريس المائية (MWM) ومتاهة Y وموقع الكائن الجديد (NOL). في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مهمة تجنب المكان النشط (APA) كبديل لهذه الأساليب التقليدية. في مهمة APA ، يجب على الفئران استخدام الإشارات المكانية الموضوعة حول ساحة دوارة لتجنب منطقة صدمة ثابتة. نظرا للمعلمات المتعددة التي يمكن تعديلها ، فقد ثبت أن مهمة APA هي نهج متعدد الاستخدامات. يفسح المجال للاستخدام طوليا وبشكل متكرر لنفس المجموعة من الفئران. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإجراء مهمة APA بنجاح. نسلط الضوء أيضا على مناهج APA البديلة التي يمكن استخدامها لفحص المكونات المختلفة للتعلم المكاني. نحن نصف عمليات جمع البيانات وتحليلها. تتم مناقشة الخطوات الحاسمة أثناء مهمة APA لزيادة احتمالية إجراء الاختبار بنجاح. تتميز مهمة APA بالعديد من المزايا مقارنة باختبارات التنقل المكاني التقليدية. من المناسب استخدامه مع الفئران المسنة أو تلك التي تعاني من الأنماط الظاهرية للأمراض مثل مرض الزهايمر. يمكن تغيير تعقيد المهمة بسهولة ، مما يسمح باختبار مجموعة واسعة من سلالات الماوس. علاوة على ذلك ، فإن مهمة APA مناسبة لاختبار التي خضعت لعملية جراحية أو تدخلات تجريبية قد تكون أثرت على الوظيفة الحركية أو العصبية ، مثل السكتة الدماغية أو إصابات الدماغ.
Introduction
يعد تجنب المكان النشط (APA) أداة فعالة لاختبار التعلم المكاني المعتمد على الحصين في القوارض1،2،3،4. أثناء مهمة APA ، يتم وضع في ساحة دوارة ويطلب منه استخدام الإشارات المرئية لتوجيه نفسه وتجنب منطقة الصدمةالمكروهة 5. يضمن دوران الساحة أن الماوس غير قادر على استخدام نهج غبي للملاحة ، ولا يمكن استخدام علامات الرائحة ، حيث تدور هذه الإشارات على المنصة بينما تظل منطقة الصدمة ثابتة5. يسمح تغيير سرعة واتجاه الساحة ، بالإضافة إلى موقع منطقة الصدمة والإشارات البصرية ، بإعادة اختبار الفئران عدة مرات6،7،8. تقدم APA العديد من المزايا المميزة مقارنة بمتاهة موريس المائية (MWM) ، وهي واحدة من أكثر اختبارات التعلم المكاني استخداما. الأهم من ذلك ، أن الفئران لديها نفور من السباحة وتجد مهمة MWM مرهقة للغاية9. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن طفو الفئران المسنة أثناء مهمة MWM10 ، مما يجعلها غير مناسبة كمهمة تعلم مكاني في كثير من الحالات. علاوة على ذلك ، نظرا لأن مهمة MWM تتطلب منصة مخفية مغمورة للفئران لتحديد موقعها أثناء الاختبار. هذا يستلزم أن يكون الماء معتما ، والذي يتحقق عادة عن طريق إضافة الطلاء الأبيض. يتطلب تتبع وتحليلها أثناء المهام السلوكية تباينا كافيا بين الموضوع والمناطق المحيطة ، باستثناء سلالات معينة من الفئران مثل Swiss أو BALB / c من الاختبار في MWM. في مهمة APA ، يتم التحايل على هذه المشكلة من خلال إضافة البلاستيك الأسود تحت الشبكة.
تم تصميم نماذج APA متعددة لاختبار التعلم المكاني ، مما يدل على فائدته كأداة سلوكية فعالة. على سبيل المثال ، يتم اكتساب التعلم المكاني والاحتفاظ به وتوحيده عادة عن طريق الاختبار اليومي للحيوانات التي يمكن أن تتراوح من 3-5 أيام6،7،11،12. يتم قياس الذاكرة والتعلم من خلال مقارنة عدد الصدمات التي يتم تلقيها كل يوم اكتساب. الوقت حتى المدخل الأول والحد الأقصى للوقت لتجنب منطقة الصدمة هي أيضا معلمات مهمة يمكن استخدامها لتحديد التغييرات في القدرة على التعلم أثناء المهمة. بدلا من ذلك ، يمكن اختبار الذاكرة العاملة المكانية عن طريق إجراء جلسة APA واحدة مدتها 30 دقيقة 2,13 حيث يتم قياس التعلم المكاني على أنه تغييرات داخل الجلسة من خلال مقارنة الأداء ، مثل رقم الصدمة ، في صناديق 5 دقائق.
في هذه المقالة ، نصف مهمة APA ونسلط الضوء على الميزات الرئيسية التي يجب مراعاتها عند إجراء اختبار التعلم المكاني هذا.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة كوينزلاند بموجب المبادئ التوجيهية للمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (رقم الموافقة: QBI / 189/15).
1. إعداد غرفة APA
ملاحظة: يتكون جهاز APA من ساحة مرتفعة بأرضية شبكية معدنية محاطة بحدود دائرية شفافة بارتفاع 32 سم. القضبان المعدنية متباعدة بشكل متساو (0.5 سم) وقطرها 0.3 سم.
- تأكد من وجود جهاز APA داخل إطار الكاميرا المثبت على السقف. تتبع الماوس باستخدام برنامج تتبع المتاح تجاريا.
- تدور ساحة APA بشكل عام بسرعة 1 دورة في الدقيقة ، ويتم تعيين منطقة صدمة ثابتة محددة مسبقا بزاوية 60 درجة داخل الساحة الدوارة. عندما يدخل الماوس منطقة الصدمة ، قم بتوصيل صدمة قدم خفيفة تبلغ 0.5 مللي أمبير (60 هرتز ، 500 مللي ثانية).
- تأكد من أن موقع منطقة الصدمة يظل ثابتا أثناء الاختبار ويتم ضبطه إلكترونيا ضمن الإعداد التجريبي. تحمل الساحة الدوارة الماوس إلى منطقة الصدمة ما لم يتحرك الماوس بنشاط لتجنب ذلك.
- ضع أربع إشارات بصرية جديدة على أربعة جدران مختلفة للغرفة على نفس ارتفاع المنصة الدوارة ، وعادة ما تكون على بعد 30-50 سم من الساحة. تأكد من أن الإشارات هي ألوان محايدة ، مثل الرموز أو الأشكال بالأبيض والأسود المطبوعة على ورق A3 ومغلفة لسهولة التنظيف (الشكل 1 أ).
- تأكد من أن شدة الضوء في الغرفة تتراوح بين 30-70 لوكس. تؤدي زيادة شدة الضوء إلى سلوك يشبه القلق وتقلل من الاستكشاف.
- قبل البدء ، افتح برنامج Tracker وحدد مهمة APA.
- في خيارات Tracker 2D، حدد علامة التبويب تجربة . هنا ، تأكد من تحديد تجنب المكان - إطار واحد - الموضع فقط . سيسمح ذلك بتكوين المعلمات المطلوبة. احفظ ملف التكوين واضبطه كما هو مطلوب.
- في علامة التبويب التجربة ، عين مدة التجربة في المربع وقت التجربة . مدة التجربة النموذجية هي 600 ثانية أو 10 دقائق.
- تأكد من تحديد تمكين المؤقت . قم بتغيير معلمات الصدمة في منطقة المؤقت كما تمت مناقشته أعلاه.
- أدخل التفاصيل التجريبية الشائعة في المساحة المتوفرة في منطقة إطار الغرفة في علامة التبويب التجربة . على سبيل المثال، تأكد من ملء اسم ملف الإخراج الافتراضي بالتاريخ ومعرف تجريبي بسيط ويوم الاختبار. قم بإنهاء الاسم بشرطة سفلية "_" للسماح بإضافة معرف ماوس فريد أثناء التجربة.
- في منطقة إطار الغرفة توجد أيضا علامة التبويب الأهداف . انقر فوق الزر تحرير لتوفير القدرة على ضمان تضمين الساحة بأكملها في منطقة الاهتمام. ثم حدد Arc لتوفير المعلمات القابلة للتعديل لحجم وموقع منطقة هدف الصدمة (الشكل 1B).
- افتح علامة التبويب التتبع لضبط المعلمات لضمان تتبع الفئران بنجاح. يحتوي صندوق التباين إما على خيارات داكنة أو فاتحة للسماح لكل من الفئران المظلمة (على سبيل المثال ، C57Bl / 6) أو الفاتحة (على سبيل المثال ، BALB / c). هذا يخلق تباينا فعالا بين الخلفية والفئران. عند استخدام سلالات ألبينو من الفئران ، ضع قطعة من البلاستيك الأسود تحت الساحة للسماح بتحقيق هذا التباين (الشكل 2).
- اضبط حجم الفئران ونطاقات المساحة في هذه المنطقة. قم بتعيين هذه المعلمات للتعرف على الماوس بشكل فعال عندما تكون في الساحة. بدلا من ذلك ، قم بتعيين هذه بعد الضغط على زر من المعاير .
- حدد الزر من المعاير للتأكد من أن الساحة في منطقة الاهتمام تماما.
- ابدأ تشغيل الساحة في علامة التبويب هذه للتأكد من أنه عند تدوير الساحة ، تظل الساحة في القناع. علامة التبويب هذه مهمة أيضا لتحديد عتبة التباين المناسبة. حرك الخط الأحمر في جزء العتبة لضبط حد التباين.
ملاحظة: يوضح الشكل 3A اختيار العتبة الأمثل ، كما يتضح من منطقة برتقالية صلبة و "X" زرقاء حيث يوجد الماوس. يظهر عتبة ضعيفة في الشكل 3B وتظهر فقط البرتقالي المرقط ولا يوجد "X".
- ابدأ تشغيل الساحة في علامة التبويب هذه للتأكد من أنه عند تدوير الساحة ، تظل الساحة في القناع. علامة التبويب هذه مهمة أيضا لتحديد عتبة التباين المناسبة. حرك الخط الأحمر في جزء العتبة لضبط حد التباين.
- استخدم علامة التبويب الأجهزة واضبط اتجاه الدوران وسرعة الساحة باستخدام زر السرعة. حدد كلا من السرعات الموجبة والسالبة ، والتي تمثل الدوران في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة. اضبط شدة الصدمة في قسم المصدر الحالي . الإعداد الأكثر شيوعا للفئران هو دوران 1 دورة في الدقيقة وصدمة 0.5 مللي أمبير.
- قم بتغيير كيفية أو وقت توصيل الصدمات داخل علامة التبويب المصدر الحالي .
- تأكد من تحديد الوضع الحالي إلى تعقب تابع. سيوفر هذا صدمة كهربائية عندما يتحرك الماوس إلى منطقة الصدمة.
- حدد الوقت لإعطاء صدمات في فاصل زمني يحدده المستخدم. استخدم المسارات المسجلة مسبقا لصدمة الماوس عن طريق تحديد من ملف. هذا هو توفير ماوس تحكم محير يتعرض لعدد مماثل من الصدمات في نفس المدة والشدة بشكل مستقل عن التعلم المكاني.
ملاحظة: تسمح علامتا التبويب إخراج الملف والنافذة بحفظ ملفات البيانات والفيديو في دليل معين. يسمح الزر من الصورة الموجود ضمن علامة التبويب File Output أيضا للمنطقة محل الاهتمام بالتقاط الساحة بأكملها ليتم تحديدها.
- تراجع خلف الستار وابدأ المحاكمة. قد يؤثر وجود المجرب بالقرب من الساحة وأي ضوضاء غير ضرورية على أداء.
- تأكد من أن أي ضوضاء ورائحة محدودة أثناء التجربة ، والتي يمكن أن توفر للماوس إشارة أخرى ، مما يؤثر على أدائها. ومن الأمثلة على ذلك ضمان إغلاق صندوق النفايات السريرية ، واستخدام الغرف التي تمت إزالتها من مساحات المختبر الصاخبة ، وتنظيف المعدات تماما بين الفئران. قد يفكر الباحثون في استخدام مولد الضوضاء البيضاء لإخفاء الضوضاء الخارجية غير ذات الصلة.
- دع فراش القفص المنزلي يظل كما هو طوال فترة الاختبار السلوكي ، لأن هذا قد يوفر تحفيزا جديدا ويؤثر على السلوك.
- لتجنب الاختلافات النهارية ، قم بإجراء الاختبار في وقت ثابت كل يوم.
2. التعود على التعامل مع المجرب
- تعامل مع كل ماوس يوميا لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة لمدة 2-3 أيام على الأقل قبل الاختبار. التعامل مع يقلل بشكل كبير من التوتر والسلوك المرتبط بالقلق أثناء الاختبار.
- استخدم نفس معطف المختبر وتجنب ارتداء مزيلات العرق القوية أو الكولونيا أو العطور أثناء التعود والاختبار.
3. التعود على الساحة APA (1 يوم)
- أحضر الماوس إلى غرفة الانتظار أو غرفة الاختبار للتعود عليها. اترك الماوس ليعتاد لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. اضبط شدة الضوء في غرفة الانتظار أو غرفة الاختبار قبل إحضار الفئران لتعتاد.
- قم بإعداد برنامج Tracker.
- إنشاء مجلد خاص بالتجربة. اعتمادا على النموذج التجريبي ، لديك مجلدات منفصلة لكل يوم أو تجربة. يمكنك إعداد عمليات ضبط التجربة كما هو موضح أعلاه وحفظ عمليات الضبط هذه لاستخدامها في المستقبل.
- قبل بدء الإصدار التجريبي، افتح التكوين المحفوظ بالنقر فوق علامة التبويب ملف ، ثم انقر فوق رمز حفظ ، وأضف معرف ماوس فريدا في النافذة المفتوحة حديثا، وقم بتشغيل الإصدار التجريبي بالضغط على علامة التبويب تشغيل .
- تعويد الماوس على جهاز APA عن طريق تعريضه للساحة الدوارة لمدة 5 دقائق دون إحداث صدمات.
- أخرج الماوس من قفص المنزل عن طريق رفعه من قاعدة الذيل ووضعه برفق على يد القفاز. انقل الماوس إلى جهاز APA وضعه بعيدا عن منطقة الصدمة ، في مواجهة الحائط.
- تراجع خلف الستار وابدأ المحاكمة.
- في نهاية الاختبار ، قم بإزالة الماوس والعودة إلى قفص المنزل.
- اجمع كل البول والقطط ، ونظف الشبكة جيدا باستخدام 80٪ (v / v) من الإيثانول.
- كرر الخطوات 3.4-3.7 لجميع الفئران.
4. التدريب على الاستحواذ باستخدام APA (1-6 أيام)
- اضبط إضاءة الغرفة على نفس الظروف كما في يوم التعود.
- أحضر الماوس إلى غرفة الانتظار أو غرفة الاختبار واتركه يعتاد لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
- قم بإعداد برنامج Tracker كما هو موضح أعلاه.
- حدد مدة الفترة التجريبية.
- تأكد من تشغيل المصدر الحالي وضبطه (أي 0.5 مللي أمبير).
- ضع الماوس على الساحة بعيدا عن منطقة الصدمة ومواجهة الحائط.
- تراجع خلف الستارة وابدأ التجربة بالضغط على زر التشغيل . راقب الماوس على شاشة الكمبيوتر وتدخل إذا لزم الأمر. على سبيل المثال ، لا يتلقى الماوس صدمات أو يبدو مضغوطا بشكل مفرط ، كما يتضح من القفز المفرط أو النطق.
- في نهاية الاختبار ، قم بإزالة الماوس والعودة إلى قفص المنزل.
ملاحظة: تأكد من أن الفئران تتلقى الصدمات وتتفاعل معها. تستجيب الفئران للصدمة عن طريق تربية الظهر والنطق. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد لا يتلقون الصدمة. قد يكون هذا بسبب scat على الشبكة أو بسبب عدم كفاية التتبع. لذلك ، يعد تنظيف الشبكة بعد كل تجربة وتحسين تتبع الماوس ، كما تمت مناقشته أعلاه ، أمرا ضروريا.
5. التدريب على اكتساب الانعكاس (اختياري ، 1-6 أيام)
- في مهمة الانعكاس ، قم بتغيير موضع منطقة الصدمة إلى موقع جديد ، بشكل عام 180 درجة من الموضع السابق. قم بتقييم قدرة الماوس على التعرف بمرونة على موقع منطقة صدمة جديد. عادة لا يتم تغيير إشارات الغرفة أثناء التعلم العكسي.
- كرر الخطوات 3.4-3.7 لجميع الفئران.
6. محاكمة التحقيق (اختياري ، 1 يوم)
- في تجربة المسبار ، قم بقياس الوقت حتى المدخل الأول و / أو الحد الأقصى للوقت لتجنب منطقة الصدمة.
ملاحظة: يشير هذا إلى دمج الذاكرة بعد مرحلة الاكتساب. سيتجنب الفأر المدرب جيدا دخول منطقة الصدمة لفترة طويلة (>60 ثانية) ، مما يدل على التعلم المكاني. - اضبط شدة إضاءة الغرفة كما في يوم التدريب على الاستحواذ.
- تعويد الماوس في غرفة الاختبار أو غرفة الانتظار لمدة 30 دقيقة.
- قم بإعداد برنامج Tracker.
- اضبط مدة التجربة على نفس وقت فترة الاختبار التي تم إجراؤها مسبقا (على سبيل المثال، 10 دقائق أو 30 دقيقة، وفقا لمعلمات التجربة).
- لا توجه صدمات لهذه المحاكمة.
- ضع الماوس على الجانب الآخر من منطقة الصدمة المكروهة ، في مواجهة الحائط.
- ابدأ التجربة وتراجع خلف الستار.
- تأكد من تعقب الماوس بكفاءة.
- راقب الماوس على شاشة الكمبيوتر وأوقف التجربة عندما تدخل منطقة الصدمة. يفضل بعض الباحثين مواصلة التجربة لمدة 5 دقائق لمعرفة ما إذا كان الفأر يستمر في العودة إلى منطقة الصدمة.
- التقط الماوس برفق وعد إلى قفص المنزل.
- تأكد من جمع كل البول و scat ، ويتم تنظيف الشبكة جيدا باستخدام 80٪ (v / v) من الإيثانول.
7. تحليل المسار
ملاحظة: يمكن تحقيق أداء المهمة عبر برامج تتبع مختلفة. فيما يلي كيفية استخدام البرنامج المضمن لتحديد الأداء أثناء مهمة APA. في هذه الحالة ، يتم تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل المسار .
- لتحليل البيانات ، افتح برنامج تحليل المسار وحدد تجنب من القائمة المنسدلة في النافذة الرئيسية.
- انقر فوق إضافة مهمة لتحميل ملفات البيانات المحفوظة أثناء مرحلة الاستحواذ في نافذة جديدة. في اسم المجموعة، أنشئ مجموعة لتحليلها، على سبيل المثال، اليوم 1 أو وقت التحليل.
- انقر فوق دليل الإخراج لتحديد الموقع لحفظ البيانات التي تم تحليلها.
- أضف الملفات المراد تحليلها بالنقر فوق علامة التبويب "إضافة ملفات " وتحديد الملفات من محرك الأقراص المحلي.
- قم بتعيين الوقت المراد تحليله بالنقر فوق علامة التبويب تعيين الوقت . يوفر هذا القدرة على تحديد الفترة التي سيتم تحليلها ، أي من 0 إلى 600 ثانية. بدلا من ذلك ، قم بتحليل البيانات في الصناديق ، أي 60 ثانية.
- بمجرد إضافة جميع المسارات، انقر فوق علامة التبويب تحليل وحدد تشغيل التحليل لتحليل البيانات. سينتج التحليل عدة مجلدات. ستكون بيانات التحليل في مجلد TBLfiles . افتح ملفات البيانات هذه في جدول بيانات واستخدمها لمزيد من التحليل ، أي المقارنة الزوجية أو المقاييس المتكررة ANOVA.
ملاحظة: سينتج التحليل أيضا مجلدات أخرى ، بما في ذلك ملفات PS التي ستحتوي على وصف من صفحة واحدة للفئران أثناء الاختبار ، مع إظهار خريطة تتبع ومكان تلقي الصدمات.
Representative Results
ستظهر الفئران ذات القدرة على التعلم المكاني السليمة انخفاضا في عدد الصدمات أثناء تجارب الاستحواذ المتتالية (الشكل 4 أ). وبالمثل ، سيزداد الحد الأقصى للوقت الذي يتجنب فيه منطقة الصدمة حيث يتعلم الماوس التنقل بنجاح بعيدا عن منطقة الصدمة (الشكل 4 ب). ومع ذلك ، فإن الفئران غير القادرة على تعلم استراتيجية تجنب فعالة ستظهر عددا ثابتا من الصدمات لكل تجربة اكتساب (الشكل 4 أ). في كثير من الأحيان ، ستتلقى الفئران التي تفشل في تحديد منطقة الصدمة صدمات متعددة أثناء كل دخول إلى المنطقة. تعد خرائط التتبع مفيدة لتقديم أمثلة على الفئران التي تتعلم تجنب منطقة الصدمة (الشكل 4C) وتلك غير القادرة على تجنب منطقة الصدمة (الشكل 4D). في كلتا الحالتين ، تمثل خرائط التتبع هذه اليوم الأخير من الاستحواذ. تلقى الماوس في الشكل 4C صدمات 2 فقط ، كما تمثلها الدائرتان. لاحظ أيضا أن خريطة التتبع تظهر الماوس الذي يقضي معظم الوقت على الجانب الآخر من منطقة الصدمة التي يمثلها الإسفين الأحمر. على العكس من ذلك ، تلقى الماوس في الشكل 4D المزيد من الصدمات ، وتكشف خريطة التتبع عن نمط مضطرب. أمثلة الفئران غير القادرة على التعلم بنجاح لتجنب منطقة الصدمة هي تلك التي قللت من تكوين الخلايا العصبية الحصين إما بسبب التقدم في السن ، كما هو موضح في الفئران البالغة من العمر 18 شهرا (الشكل 4A ، B- معدل من Blackmore et al. ، 20217) ، الاجتثاث الكيميائي للخلايا العصبية غير الناضجة6 أو آفات الحصين (انظر Codd et al. ، 2020)8.
من المهم التمييز بين تجربة غير ناجحة بسبب فشل الماوس في التعلم مقابل الفشل في إعداد الجهاز. السببان الأكثر شيوعا للنتائج السيئة بسبب فشل المعدات هما ضعف تتبع الماوس (الشكل 5 أ) أو عدم تعرض الماوس لصدمة. يمكن أن يمنع التتبع السيئ الماوس من تلقي صدمة عندما يكون في منطقة الصدمة. بدلا من ذلك ، يمكن أن يؤدي التتبع الضعيف إلى حدوث صدمة بشكل غير دقيق عندما لا يكون الماوس في المنطقة. في كلتا الحالتين ، سيمنع هذا الماوس من تطوير استراتيجية تجنب فعالة. يمكن حل التتبع الضعيف عن طريق ضبط العتبة في علامة التبويب "من المعاير". عادة ما يتم تعريف التتبع الضعيف على أنه أكثر من 1000 إطار سيئ خلال فترة 10 دقائق ونادرا ما يحدث. يمكن أن يصبح التتبع السيئ مشكلة مع الفئران المسنة ، حيث يمكن أن تتطور الثعلبة. عند تلقي صدمة ، سوف يتفاعل الماوس إما عن طريق الشد أو ، في بعض الأحيان ، النطق. سيتحرك الماوس عادة ، ولو قليلا ، ويمكن رؤيته على برنامج التتبع المباشر. عندما يبقى الماوس ثابتا تماما داخل منطقة الصدمة ، سيظهر خط واضح من الصدمات (الشكل 5 ب). قد يكون هذا بسبب عدم تشغيل صندوق الصدمات أو تعليقه بين القضبان ، مما يقلل من سعة الصدمة التي يتم تسليمها إلى.
الشكل 1: جهاز APA وغرفة السلوك وإعداد منطقة الصدمة. (أ) مثال على ساحة الاختبار وإعداد الغرفة. يتم رفع جهاز APA ووضعه في وسط الغرفة ، وتحيط به إشارات بصرية جديدة. يتم استخدام الإشارات المرئية بالأبيض والأسود على نفس ارتفاع المنصة. (B). تسمح وظيفة الهدف ضمن علامة التبويب التجربة بإخفاء الساحة بأكملها وإنشاء موقع لمنطقة الصدمة. تم إنشاء منطقة صدمة ، ممثلة بالوتد الأحمر ، عند 270 درجة في هذا المثال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد APA لسلالات الفئران البيضاء. يمكن إعداد ساحة APA لسلالات الفئران البيضاء ، مثل BALB / c ، عن طريق تحديد خيار Light في علامة التبويب "التتبع " وإنشاء خلفية ساحة سوداء. يحقق الماوس الأبيض على خلفية سوداء تباينا عاليا ويوفر تتبعا أفضل للماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يعد ضبط عتبة تتبع الماوس أمرا ضروريا. يجب تعديل العتبة بشكل مناسب لضمان تتبع جيد للحيوانات أثناء التجربة. يتم ضبط العتبة عن طريق تحريك الخط الأحمر في جزء العتبة في علامة التبويب من المعاير . (أ) مثال على اختيار عتبة جيد مع منطقة برتقالية صلبة وعلامة X زرقاء على الجسم. (ب) عتبة ضعيفة مع برتقالي مرقط. يؤدي التتبع السيئ إلى فقدان في الساحة أو يمنع الماوس من تلقي صدمة عندما يكون في منطقة الصدمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مقارنة الأداء بين الفئران الصغيرة (10 أسابيع) والأكبر سنا (18 شهرا) على نموذج التعلم لمدة 5 أيام وخرائط التتبع. (أ) تلقت الفئران البالغة من العمر 10 أسابيع صدمات أقل بكثير مقارنة بالفئران البالغة من العمر 18 شهرا خلال 5 أيام من الاختبار؛ لاحظ أن الفرق في عدد الصدمات التي تم تلقيها كان ضئيلا في اليوم الأول من الاختبار بين المجموعات ، لكن الفئران الشابة ذات الذاكرة السليمة تعلمت تجنب الدخول إلى منطقة الصدمة بسرعة أكبر من المجموعة الأكبر سنا. (ب) تم حساب الحد الأقصى للوقت لتجنب الصدمة على أنه الحد الأقصى للوقت المستغرق في تجنب الصدمة أثناء التجربة البالغة 10 دقائق. وسرعان ما تعلمت الفئران الأصغر سنا تجنب الدخول إلى منطقة الصدمة مقارنة بالفئران الأكبر سنا، مما يشير إلى أن الفئران الشابة تتعلم بفعالية. (ج) تلقى الفأر في خريطة التتبع هذه صدمتين فقط ، كما تمثلهما الدائرتان في تجربة الاستحواذ هذه. قضى هذا الماوس أيضا وقتا أطول في الساحة المقابلة لمنطقة الصدمة ، والتي يمثلها الإسفين الأحمر. (د) تلقى هذا الفأر المزيد من الصدمات وقضى وقتا أطول بالقرب من منطقة الصدمة، مما يشير إلى أن التعلم المكاني لم يتحقق في هذا الفأر. تم استخدام قياس ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبارات Bonferroni اللاحقة لاختبار الأهمية. ص<0.0001. تم تعديل اللوحتين A و B من Blackmore et al.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: توفر خرائط التتبع معلومات مهمة لكل ماوس خلال كل تجربة. (أ) لاحظ الخطوط المستقيمة الموجودة في مثال التتبع هذا. ويرجع ذلك إلى أن برنامج التتبع يحدد الماوس بشكل غير صحيح أثناء المهمة. (ب) مثال على التتبع الجيد أثناء المحاكمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تتبع التصور وخريطة التمثيل اللوني في برامج تتبع المختلفة. يكتشف كل من (أ) البرنامج 1 و (ب) البرنامج 2 موقع وحركته لإنشاء مخططات تتبع لفحص بصريا ما إذا كان يتعلم المهمة أو تأثير العلاج التجريبي. يظهر كلا البرنامجين مؤامرات مسار متطابقة من تعلم المهمة بكفاءة. (ج) يمكن أيضا إنشاء خريطة حرارية ، مما يسهل تحديد النقاط الساخنة وتجميع نقاط البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
في الختام ، يعد اختبار تجنب المكان النشط مهمة تعلم مكانية فعالة يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من سلالات الفئران والظروف التجريبية. تتغلب مهمة APA على القيود المرتبطة بنماذج التعلم المكاني الأخرى14 ، مثل MWM ، وهو أمر مرهق للفئران كما تم قياسه بمستويات الكورتيزول9. كما أن MWM غير مناسب للفئران المسنة ، حيث تم الإبلاغ عن أنها تطفو أثناء المهمة10. على الرغم من أن اختبارات التعلم المكاني الأخرى ، مثل متاهة بارنز واختبار موقع الكائن الجديد ، أقل إرهاقا ، إلا أنها محدودة بعدد المرات التي يمكن فيها إجراء الاختبار المتكرر على نفس المجموعة من الفئران. لذلك ، فإن الميزة الرئيسية لمهمة APA هي أنه يمكن استخدامها عدة مرات حيث يمكن تعديل العديد من المعلمات للحفاظ على الجدة. في الواقع ، لقد استخدمنا مهمة APA حتى 5 مرات على نفس المجموعة من الفئران لفحص تأثير استئصال الحصين والتأثير اللاحق للتمرين8. في كل حالة ، تم تغيير المعلمات ، بما في ذلك دوران الساحة ومنطقة الصدمة والإشارات المكانية ، بين الاختبارات. كان هذا فعالا في ضمان استخدام الفئران لإشارات الملاحة المكانية لإعادة تعلم المهمة كما يتضح من الضابطة التي تبدأ بعدد كبير من الصدمات ثم تتناقص خلال أيام الاختبار اللاحقة لكل فترةاختبار 8. عادة ، في نهاية نموذج الاختبار لمدة 5 أيام ، نعتبر أن أي تلقى أكثر من 10 صدمات في اليوم الأخير أو لديه تجنب أقصى أقل من 60 ثانية لم يتعلم النموذج.
بالإضافة إلى القدرة على تعديل الإعدادات بسهولة للسماح بجولات متعددة من الاختبار المكاني ، تضمن مهمة APA أنه يجب على الفئران استخدام التنقل المكاني لتجنب منطقة الصدمة بشكل فعال. على سبيل المثال ، يجب على استخدام إشارات خارجية لتحديد موقع منطقة الصدمة الثابتة وتجنب دخولها عن طريق التنقل بعيدا عنها5. نظرا لأن الساحة تدور ، لا تستطيع استخدام نهج غبي للملاحة ، ولا يمكنها استخدام إشارات خارجية مثل الرائحة لأن هذه الإشارات تدور مع الساحة بينما تظل منطقة الصدمة والإشارات المكانية ثابتة5.
من المهم أيضا التأكد من أن الفئران معتادة بشكل مناسب على الباحث وساحة APA. يجب أيضا تحسين شدة صدمة القدم ، حيث يمكن أن تؤثر شدة الصدمة المنخفضة جدا والعالية جدا على قدرة الفئران على التعلم وأداء المهمة5. عادة ما يتم ضبط شدة الصدمة على 0.5 مللي أمبير ويجب ألا تتجاوز 0.7 مللي أمبير. بالنسبة للحيوانات التي زادت من سلوكها الشبيه بالقلق ، فكر في تقليل شدة الضوء وشدة صدمة القدم. يمكن أن يظهر القلق المتزايد أثناء مهمة APA إما على شكل قفز مفرط أو تشغيل غير منضبط داخل الساحة أو تجميد طويل. استخدم البروتوكول الموصوف هنا شدة صدمة تبلغ 0.5 مللي أمبير ، وهي نفس الشدة التي تم استخدامها سابقا مع BALB / c ، والتي من المعروف أن لديها سلوكا شبيها بالقلقأعلى 15.
هنا ، نصف برنامج تتبع الذي توفره الشركة التي قدمت جهاز تجنب المكان النشط المستخدم. برنامج تتبع الفيديو البديل مناسب أيضا لتحليل الأداء السلوكي. يمكن لهذه البرامج أيضا قياس أداء الماوس وتحليله بدقة أثناء مهام APA. تسمح هذه البرامج بإنشاء عدة مناطق ومواقع داخل ساحة APA لتقييم السلوك. يتكون إعداد الساحة ل APA من منطقة صدمة مثلثة واحدة ، حيث يتم قياس عدد المداخل ووقت الدخول لأول مرة والوقت المستغرق في منطقة الصدمة. يمكن أيضا إضافة مناطق إضافية داخل الساحة. على سبيل المثال ، يمكننا إضافة منطقة مركزية أو منطقة مقابلة لمنطقة الصدمة لقياس الوقت المستغرق ، والمسافة المقطوعة في تلك المناطق كاستراتيجية حيوانية لتجنب المنطقة المكروهة. تتعقب هذه البرامج مركز كتلة الماوس ، والذي يتم حفظه وعرضه بعد ذلك فوق الإطار المرجعي للفحص البصري (الشكل 6A ، B). أخيرا ، من الممكن أيضا إنشاء خريطة حرارية للكثافة للأداء الفردي والجماعي (الشكل 6C).
عند إجراء مهمة APA ، هناك مشكلات محتملة تحتاج إلى معالجة. في بعض الأحيان ، يجب استبعاد الفئران من التحليل بسبب عدم الاستجابة لمنطقة الصدمة. كما هو الحال دائما ، يجب النظر في الاستبعاد فقط عندما يستوفون الشروط الشاذة المحددة مسبقا ، على سبيل المثال ، الوقوع خارج 2 انحرافات معيارية عن المتوسط. تتطلب المهام السلوكية المعقدة مثل APA عادة قيم N عالية للحيوانات. نقترح إجراء تحليل للطاقة لحساب حجم العينة المناسب قبل إجراء APA. هذا يعتمد على السلالة المستخدمة ومجموعات العلاج. من التجربة ، نجد أن قيمة n 10 أو أكثر لكل مجموعة توفر طاقة كافية عند إجراء تجارب APA. المشكلة الرئيسية في هذه المهمة هي ضمان تتبع عالي الجودة للماوس أثناء المهمة. يجب استخدام مرحلة التعود على المهمة لتأكيد حدوث ذلك. غالبا ما تكون الفئران التي لا تستجيب للصدمة بسبب scat بين قضبان الشبكة. لذلك ، من الضروري تنظيف الحفارة بعد كل حيوان وإزالة أي سكات أو بول. هذا سوف يقلل أيضا من الضغط على التي تليها. تتضمن مهمة APA عادة نموذجا مدته 5 أيام ، والذي قد يمثل بعض القيود على الدراسات التي تتضمن تدخلات فعالة أقل من 5 أيام ؛ ومع ذلك ، لا يزال من الممكن تقييم الذاكرة قصيرة المدى أو اكتساب التعلم المكاني لمثل هذه الدراسات باستخدام نهج 30 دقيقة لجلسة واحدة.
باختصار ، تقدم هذه المقالة وصفا تفصيليا لكيفية إعداد واستخدام نموذج تجنب المكان النشط لاختبار التعلم المكاني للفئران. تعد القدرة على تغيير الظروف بحيث يمكن اختبار سلالات الماوس المتعددة ذات الألوان المختلفة ميزة واضحة على الاختبارات المكانية الأخرى الأكثر تقليدية مثل MWM. علاوة على ذلك ، يسمح تعديل المعلمات المتعددة بتكرار الاختبار بحيث يمكن مقارنة التغييرات في التعلم المكاني بدقة خلال النماذج التجريبية المختلفة أو أثناء الشيخوخة الفسيولوجية. في فترة زمنية قصيرة ، ثبت أن اختبار APA بديل دقيق وفعال للتعلم المكاني المعتمد على الحصين. في المستقبل ، يمكن استخدام مهمة APA كطريقة موثوقة لتقييم التدخلات العلاجية أو التمارين على السلوك المعرفي والمكاني في كل من الفئران البرية والمحورة وراثيا.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر مرفق سلوك التابع لمعهد كوينزلاند للدماغ (QBI) على تطوير وصيانة الجهاز الموصوف في هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
References
- Cimadevilla, J. M., Fenton, A. A., Bures, J. Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats. Neurosci Lett. 285 (1), 53-56 (2000).
- Willis, E. F., Bartlett, P. F., Vukovic, J. Protocol for short- and longer-term spatial learning and memory in mice. Front Behav Neurosci. 11, 197 (2017).
- Blackmore, D. G., Brici, D., Walker, T. L. Protocol for three alternative paradigms to test spatial learning and memory in mice. STAR Protoc. 3 (3), 101500 (2022).
- Pastalkova, E., et al. Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP. Science. 313 (5790), 1141-1144 (2006).
- Stuchlik, A., et al. Place avoidance tasks as tools in the behavioral neuroscience of learning and memory. Physiol Res. 62 (Suppl 1), S1-S19 (2013).
- Vukovic, J., et al. Immature doublecortin-positive hippocampal neurons are important for learning but not for remembering. J Neurosci. 33 (15), 6603-6613 (2013).
- Blackmore, D. G., et al. An exercise "sweet spot" reverses cognitive deficits of aging by growth-hormone-induced neurogenesis. iScience. 24 (11), 103275 (2021).
- Codd, L. N., Blackmore, D. G., Vukovic, J., Bartlett, P. F. Exercise reverses learning deficits induced by hippocampal injury by promoting neurogenesis. Sci Rep. 10 (1), 19269 (2020).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behav Brain Res. 198 (1), 247-251 (2009).
- van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C., Gage, F. H. Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice. J Neurosci. 25 (38), 8680-8685 (2005).
- Zhou, X. A., et al. Neurogenic-dependent changes in hippocampal circuitry underlie the procognitive effect of exercise in aging mice. iScience. 24 (12), 103450 (2021).
- Leinenga, G., Gotz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 278ra33 (2015).
- Willis, E. F., et al. Repopulating microglia promote brain repair in an IL-6-dependent manner. Cell. 180 (5), 833-846 (2020).
- Lesburgueres, E., Sparks, F. T., O'Reilly, K. C., Fenton, A. A. Active place avoidance is no more stressful than unreinforced exploration of a familiar environment. Hippocampus. 26 (12), 1481-1485 (2016).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
