APA-testen (Active Place Avoid), en effektiv, alsidig og repeterbar rumlig læringsopgave for mus

Summary

Her præsenterer vi en protokol for den aktive stedundgåelsestest, et hippocampusafhængigt rumligt læringsparadigme designet til gnavere. Ændring af nøgleparametre gør det muligt at teste dyr igen før og efter behandlingerne eller over tid.

Abstract

Hippocampus-afhængig rumlig læring hos gnavere er blevet testet ved hjælp af en række forskellige metoder. Disse omfatter Morris vandlabyrint (MWM), Y-labyrint og nye objektplaceringsopgaver (NOL). For nylig er APA-opgaven (active place avoid) blevet udviklet som et alternativ til disse mere traditionelle tilgange. I APA-opgaven skal mus bruge rumlige signaler placeret omkring en roterende arena for at undgå en stationær stødzone. På grund af de mange parametre, der kan justeres, har APA-opgaven vist sig at være en meget alsidig tilgang. Det egner sig til at blive brugt i længderetningen og gentagne gange til den samme kohorte af mus. Her giver vi en detaljeret protokol til at udføre APA-opgaven med succes. Vi fremhæver også alternative APA-tilgange, der kan bruges til at undersøge forskellige komponenter i rumlig læring. Vi beskriver dataindsamlings- og analyseprocesserne. Kritiske trin under APA-opgaven diskuteres for at øge sandsynligheden for en vellykket gennemførelse af testen. APA-opgaven har flere fordele i forhold til mere traditionelle rumlige navigationstest. Det er hensigtsmæssigt at anvende det sammen med ældre mus eller mus med sygdomsfænotyper såsom Alzheimers sygdom. Opgavens kompleksitet kan let ændres, hvilket gør det muligt at teste en lang række musestammer. Desuden er APA-opgaven velegnet til test af dyr, der har gennemgået kirurgi eller eksperimentelle indgreb, der kan have påvirket motorisk eller neural funktion, såsom slagtilfælde eller traumatisk hjerneskade.

Introduction

Aktiv stedundgåelse (APA) er et effektivt værktøj til at teste hippocampusafhængig rumlig læring hos gnavere 1,2,3,4. Under APA-opgaven placeres dyret på en roterende arena og skal bruge visuelle signaler til at orientere sig og undgå en aversiv chokzone⁵. Arenaens rotation sikrer, at musen ikke er i stand til at bruge en idiotetisk tilgang til navigation, og der kan heller ikke bruges duftmærker, da disse signaler roterer på platformen, mens stødzonen forbliver stationær⁵. Ændring af arenaens hastighed og retning samt placeringen af stødzonen og visuelle signaler giver mulighed for gentest af mus flere gange ^6,7,8. APA tilbyder flere forskellige fordele sammenlignet med Morris vandlabyrint (MWM), en af de mest anvendte rumlige læringstests. Det er vigtigt, at mus har en modvilje mod svømning og finder MWM-opgaven ekstremt stressende⁹. Desuden er ældre mus blevet rapporteret at flyde under MWM-opgave¹⁰, hvilket gør det uegnet som en rumlig læringsopgave i mange tilfælde. Yderligere, da MWM-opgaven kræver en skjult, nedsænket platform, som musene kan lokalisere under test. Dette kræver, at vandet er uigennemsigtigt, hvilket typisk opnås ved tilsætning af hvid maling. Sporing og analyse af dyr under adfærdsopgaver kræver tilstrækkelig kontrast mellem emne og omgivelser, hvilket udelukker visse musestammer som Swiss eller BALB / c fra at blive testet i MWM. I APA-opgaven omgås dette problem ved tilsætning af sort plast under nettet.

Flere APA-paradigmer er designet til at teste rumlig læring og demonstrere dens anvendelighed som et effektivt adfærdsværktøj. For eksempel opnås erhvervelse, fastholdelse og konsolidering af rumlig læring typisk ved daglig test af dyr, der kan variere fra 3-5 dage 6,7,11,12. Hukommelse og læring kvantificeres ved at sammenligne antallet af stød, der modtages hver erhvervelsesdag. Tid til første indgang og den maksimale tid, der undgår stødzonen, er også vigtige parametre, der kan bruges til at bestemme ændringer i indlæringsevne under opgaven. Alternativt kan rumlig arbejdshukommelse testes ved at udføre en enkelt 30 minutters APA-session ^2,13, hvor rumlig læring måles som ændringer inden for sessionen ved at sammenligne ydeevne, såsom stødtal, i 5 minutters skraldespande.

I denne artikel beskriver vi APA-opgaven og fremhæver de nøglefunktioner, der skal overvejes, når du udfører denne rumlige læringstest.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Queensland Animal Ethics Committee i henhold til retningslinjerne fra National Health and Medical Research Council of Australia (godkendelsesnummer: QBI/189/15).

1. Opsætning af APA-rum

BEMÆRK: APA-apparatet består af en forhøjet arena med et metalgittergulv omgivet af en 32 cm høj gennemsigtig cirkulær grænse. Metalstængerne er jævnt fordelt (0,5 cm fra hinanden) og har en diameter på 0,3 cm.

1. Sørg for, at APA-apparatet er inden for kamerarammen monteret i loftet. Spor musen ved hjælp af kommercielt tilgængelig dyresporingssoftware.
2. APA-arenaen roterer generelt med 1 omdr./min. hastighed, og en forudbestemt 60° stationær stødzone er indstillet inden for den roterende arena. Når musen kommer ind i stødzonen, skal du levere et mildt fodstød på 0,5 mA (60 Hz, 500 ms).
3. Sørg for, at placeringen af stødzonen forbliver konstant under testen og indstilles elektronisk i forsøgsopsætningen. Den roterende arena fører musen ind i stødzonen, medmindre musen aktivt bevæger sig for at undgå den.
4. Placer fire nye visuelle signaler på fire forskellige rumvægge i samme højde som den roterende platform, typisk 30-50 cm væk fra arenaen. Sørg for, at signalerne er neutrale farver, f.eks. sort-hvide symboler eller figurer, der er trykt på A3-papir og lamineret for nem rengøring (figur 1A).
5. Sørg for, at rummets lysintensitet er mellem 30-70 Lux. Øget lysintensitet fremkalder angstlignende adfærd og reducerer udforskning.
6. Før du starter, skal du åbne Tracker-programmet og vælge APA-opgaven.
7. I Indstillinger for Tracker 2D skal du vælge fanen Eksperiment . Her skal du sikre dig, at Placer undgåelse - Kun en ramme - Kun position er valgt. Dette gør det muligt at konfigurere de krævede parametre. Gem konfigurationsfilen, og juster efter behov.
8. På fanen Eksperiment skal du angive eksperimentets varighed i feltet Eksperimenttidspunkt . Et typisk eksperiments varighed er 600 s eller 10 min.
9. Sørg for, at Aktivér timer er valgt. Skift stødparametrene i timerområdet som beskrevet ovenfor.
10. Angiv de almindelige eksperimentoplysninger i det felt, der er angivet i området Rumramme under fanen Eksperiment . Sørg f.eks. for, at standardoutputfilnavnet udfyldes med datoen, et simpelt eksperimentelt id og testdagen. Afslut navnet med et understregningstegn "_" for at tillade tilføjelse af et entydigt muse-id under eksperimentet.
11. I området Rumramme er der også fanen Mål . Klik på knappen Rediger for at give mulighed for at sikre, at hele arenaen er inkluderet i interesseområdet. Vælg derefter Arc for at angive de justerbare parametre for størrelsen og placeringen af stødmålzonen (figur 1B).
12. Åbn fanen Sporing for at justere parametrene for at sikre vellykket musesporing. Kontrastboksen har enten mørke eller lyse indstillinger for at tage højde for både mørke (f.eks. C57Bl/6) eller lyse (f.eks. BALB/c) mus. Dette skaber en effektiv kontrast mellem baggrunden og musene. Når du bruger albinostammer af mus, skal du placere et stykke sort plast under arenaen for at muliggøre denne kontrast (figur 2).
13. Indstil musenes størrelse og arealintervaller i dette område. Indstil disse parametre til effektivt at genkende musen, når den er i arenaen. Alternativt kan du indstille disse efter at have trykket på knappen Fra kalibrator .
14. Vælg knappen Fra kalibrator for at sikre, at arenaen er helt i interesseområdet.
    1. Start arenaen på denne fane for at sikre, at arenaen forbliver i masken, når arenaen roterer. Denne fane er også afgørende for at vælge den passende kontrasttærskel. Flyt den røde linje i ruden Tærskel for at justere kontrasttærsklen.
       BEMÆRK: Figur 3A viser et optimalt tærskelvalg, som det fremgår af et solidt orange område og et blåt "X", hvor musen er placeret. En dårlig tærskel er vist i figur 3B og viser kun plettet orange og intet "X".
15. Brug fanen Enheder , og indstil arenaens rotationsretning og hastighed ved hjælp af hastighedsknappen. Vælg både positive og negative hastigheder, der repræsenterer rotationer med og mod uret. Indstil stødintensiteten i afsnittet Aktuel kilde . Den mest almindelige indstilling for mus er 1 o / min rotation og et 0,5 mA stød.
16. Rediger, hvordan eller hvornår stødene skal leveres under fanen Aktuel kilde .
    1. Sørg for, at den aktuelle tilstand er valgt til Spor afhængig. Dette vil give et elektrisk stød, når musen bevæger sig ind i stødzonen.
    2. Vælg Tid for at give stød med et tidsinterval, der er indstillet af brugeren. Brug tidligere optagede spor til at chokere en mus ved at vælge Fra fil. Dette er for at give en åg kontrolmus udsat for et identisk antal stød af samme varighed og intensitet uafhængigt af rumlig læring.
       BEMÆRK: Fanerne Filoutput og Vindue tillader, at data og videofiler gemmes i en bestemt mappe. Det Fra billede knappen i File Output fanen tillader også regionen af interesse at fange hele arenaen, der skal vælges.
17. Træk dig tilbage bag gardinet og begynd retssagen. Eksperimentets tilstedeværelse tæt på arenaen og enhver unødig støj kan påvirke dyrenes ydeevne.
18. Sørg for, at støj og lugt er begrænset under forsøget, hvilket kan give musen et andet signal, der påvirker deres ydeevne. Eksempler på at minimere dette inkluderer at sikre en lukket klinisk affaldsspand, bruge rum fjernet fra støjende laboratorierum og grundigt rengøre udstyret mellem mus. Forskere kan overveje at bruge den hvide støjgenerator til at maskere ikke-relaterede eksterne lyde.
19. Lad hjemmeburstrøelsen forblive den samme i hele adfærdstestperioden, da dette kan give ny stimulering og påvirke adfærden.
20. For at undgå daglige variationer skal du udføre test på et ensartet tidspunkt hver dag.

2. Tilvænning til eksperimenthåndtering

1. Håndter hver mus dagligt i 30 sekunder til 1 min i mindst 2-3 dage før testen. Håndtering af dyr reducerer signifikant stress og angstrelateret adfærd under test.
2. Brug den samme laboratoriefrakke og undgå at bære stærke deodoranter, colognes eller parfume under tilvænning og test.

3. Tilvænning til APA-arenaen (1 dag)

1. Bring musen ind i forrummet eller testrummet til tilvænning. Lad musen vænne sig i mindst 30 min. Indstil lysintensiteten i forrummet eller testrummet, før mus bringes ind for at vænne sig.
2. Konfigurer sporingssoftwaren.
   1. Opret en eksperimentspecifik mappe. Afhængigt af det eksperimentelle paradigme skal du have separate mapper for hver dag eller prøveperiode. Konfigurer eksperimentkonfigurationer som beskrevet ovenfor, og gem disse konfigurationer til fremtidig brug.
   2. Før du starter en prøveversion, skal du åbne den gemte konfiguration ved at klikke på fanen Filer og derefter klikke på symbolet Gem , tilføje et unikt muse-id i det nyåbnede vindue og køre prøveversionen ved at trykke på fanen Afspil .
3. Væn musen til APA-apparatet ved at udsætte den for den roterende arena i 5 minutter uden at levere stød.
4. Fjern musen fra hjemmeburet ved at løfte den fra halens base og forsigtigt placere den på den handskede hånd. Transport musen til APA-apparatet og placer den væk fra stødzonen mod væggen.
5. Træk dig tilbage bag gardinet og begynd retssagen.
6. Ved afslutningen af testen skal du fjerne musen og vende tilbage til hjemmeburet.
7. Opsaml al urin og scat, og rengør gitteret grundigt med 80% (v / v) ethanol.
8. Gentag trin 3.4-3.7 for alle mus.

4. Erhvervelsestræning ved hjælp af APA (1-6 dage)

1. Indstil rumbelysningen til identiske forhold som på tilvænningsdagen.
2. Før musen ind i forrummet eller testrummet, og lad den vænne sig i mindst 30 minutter.
3. Konfigurer sporingssoftwaren som beskrevet ovenfor.
4. Indstil varigheden af prøveperioden.
5. Sørg for, at den aktuelle kilde er tændt og indstillet (dvs. 0,5 mA).
6. Placer musen på arenaen væk fra stødzonen og vendt mod væggen.
7. Træk dig tilbage bag gardinet, og start prøveperioden ved at trykke på knappen Afspil . Overvåg musen på computerskærmen, og gribe ind, hvis det er nødvendigt. For eksempel modtager musen ikke stød eller virker alt for stresset, som det fremgår af overdreven hoppe eller vokalisering.
8. Ved afslutningen af testen skal du fjerne musen og vende tilbage til hjemmeburet.
   BEMÆRK: Sørg for, at mus modtager og reagerer på stødene. Mus reagerer på chokket ved at bakke tilbage og vokalisere. Hvis dette ikke er tilfældet, modtager de muligvis ikke chokket. Dette kan skyldes scat på nettet eller på grund af utilstrækkelig sporing. Derfor er det vigtigt at rense gitteret efter hvert forsøg og optimere musesporingen, som diskuteret ovenfor.

5. Træning i tilbageførsel (valgfrit, 1-6 dage)

1. I vendeopgaven skal du flytte stødzonen til en ny placering, normalt 180° fra den forrige position. Vurder musens evne til fleksibelt at lære en ny stødzoneplacering. Rumsignalerne ændres typisk ikke under omvendt læring.
2. Gentag trin 3.4-3.7 for alle mus.

6. Sondeforsøg (valgfrit, 1 dag)

1. I sondeforsøget måles tiden til den første indgang og/eller den maksimale tid, der undgår stødzonen.
   BEMÆRK: Dette indikerer hukommelseskonsolidering efter anskaffelsesfasen. En veltrænet mus undgår at komme ind i stødzonen i længere tid (>60 sek.), hvilket viser tegn på rumlig læring.
2. Indstil rummets lysintensitet som på anskaffelsestræningsdagen.
3. Habituer musen i testrummet eller forrummet i 30 min.
4. Konfigurer sporingssoftwaren.
5. Indstil forsøgsvarigheden til samme tid som den tidligere udførte testperiode (f.eks. 10 min eller 30 min, afhængigt af testparametrene).
6. Giv ikke stød til denne prøve.
7. Placer musen på den modsatte side af den aversive stødzone, der vender mod væggen.
8. Start retssagen og træk dig tilbage bag gardinet.
9. Sørg for, at musen spores effektivt.
10. Overvåg musen på computerskærmen, og stop forsøget, når det kommer ind i stødzonen. Nogle forskere foretrækker at fortsætte forsøget i 5 minutter for at se, om musen fortsætter med at vende tilbage til chokzonen.
11. Tag forsigtigt musen op og vend tilbage til hjemmeburet.
12. Sørg for, at al urin og scat opsamles, og at gitteret rengøres grundigt med 80% (v / v) ethanol.

7. Spor analyse

BEMÆRK: Udførelsen af opgaven kan opnås via forskellige sporingssoftware. Nedenfor er, hvordan den medfølgende software bruges til at bestemme ydeevnen under APA-opgaven. I dette tilfælde analyseres dataene ved hjælp af programmet Track Analysis .

1. For at analysere dataene skal du åbne programmet Track Analysis og vælge Undgåelse i rullemenuen i hovedvinduet.
2. Klik på Tilføj opgave for at uploade de datafiler, der er gemt i anskaffelsesfasen, i et nyt vindue. Opret en gruppe i Gruppenavn, der skal analyseres, f.eks. dag 1 eller analysetidspunkt.
3. Klik på Output Directory for at vælge placeringen for at gemme de analyserede data.
4. Tilføj de filer, der skal analyseres, ved at klikke på fanen Tilføj filer og vælge filerne fra det lokale drev.
5. Indstil den tid, der skal analyseres, ved at klikke på fanen Indstil tid . Dette giver mulighed for at definere den periode, der skal analyseres, dvs. 0 til 600 s. Alternativt kan du analysere dataene i skraldespande, dvs. 60 s.
6. Når alle spor er tilføjet, skal du klikke på fanen Analyse og vælge Kør analyse for at analysere dataene. Analysen vil producere flere mapper. Dataene til analyse findes i mappen TBLfiles . Åbn disse datafiler i et regneark og brug dem til yderligere analyse, dvs. parvis sammenligning eller gentagne målinger ANOVA.
   BEMÆRK: Analysen vil også producere andre mapper, herunder PS-filer, der vil have en enkeltsidet beskrivelse af musene under test, der viser et sporkort, og hvor stødene blev modtaget.

Representative Results

Mus med intakt rumlig indlæringsevne vil vise et fald i antallet af chok under successive erhvervelsesforsøg (figur 4A). På samme måde øges den maksimale tid, der undgår stødzonen, efterhånden som musen lærer at navigere væk fra stødzonen (figur 4B). Mus, der ikke er i stand til at lære en effektiv undgåelsesstrategi, vil dog vise et konstant antal chok for hvert erhvervelsesforsøg (figur 4A). Ofte vil mus, der ikke identificerer stødzonen, modtage flere stød under hver indgang til zonen. Sporingskort er nyttige til at give eksempler på mus, der lærer at undgå stødzonen (figur 4C), og dem, der ikke er i stand til at undgå stødzonen (figur 4D). I begge tilfælde repræsenterer disse sporingskort den sidste dag for erhvervelsen. Musen i figur 4C modtog kun 2 stød, som repræsenteret af de to cirkler. Bemærk også, at sporingskortet viser, at musen bruger det meste af tiden på den modsatte side af stødzonen, som er repræsenteret af den røde kile. Omvendt fik musen i figur 4D flere stød, og sporkortet afslører et uordnet mønster. Eksempler på mus, der ikke er i stand til med succes at lære at undgå chokzonen, er dem, der har reduceret hippocampus neurogenese enten på grund af ældre alder, som vist af de 18 måneder gamle mus (figur 4A, B- modificeret fra Blackmore et al., 2021⁷), kemisk ablation af umodne neuroner⁶ eller hippocampale læsioner (se Codd et al., 2020)⁸.

Det er vigtigt at skelne mellem et mislykket forsøg, fordi musen ikke lærer noget, og en fejl i opsætningen af udstyret. De to mest almindelige årsager til dårlige resultater på grund af udstyrsfejl er dårlig sporing af musen (figur 5A) eller musen, der ikke modtager et stød. Dårlig sporing kan forhindre musen i at modtage et stød, når den er i stødzonen. Alternativt kan dårlig sporing unøjagtigt fremkalde et stød, når musen ikke er i zonen. I begge tilfælde forhindrer dette musen i at udvikle en effektiv undgåelsesstrategi. Dårlig sporing kan løses ved at justere tærsklen på fanen "Fra kalibrator". Dårlig sporing defineres typisk som mere end 1000 dårlige rammer i løbet af en periode på 10 minutter og forekommer meget sjældent. Dårlig sporing kan blive et problem med ældre mus, hvor alopeci kan udvikle sig. Når du modtager et stød, reagerer musen enten ved at spænde eller lejlighedsvis vokalisere. Musen vil typisk bevæge sig, hvis endda lidt, og kan ses på live tracking software. Når musen forbliver helt stille inden for stødzonen, vises en klar linje af stød (figur 5B). Dette kan skyldes, at stødboksen ikke tændes, eller at scat sidder fast mellem stængerne, hvilket reducerer amplituden af stødet, der leveres til dyret.

Figur 1: APA-apparat, adfærdsrum og indstilling af stødzone. (A) Et eksempel på testarena og rumopsætning. APA-apparatet er forhøjet og placeret i midten af rummet omgivet af nye visuelle signaler. Sort-hvide visuelle signaler bruges i samme højde som platformen. (B). Målfunktionen under fanen Eksperiment tillader maskering af hele arenaen og opretter en placering af stødzonen. En stødzone, repræsenteret af den røde kile, er blevet oprettet ved 270° i dette eksempel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: APA-opsætning for albino-musestammer. APA-arenaen kan konfigureres til albinostammer af mus, såsom BALB / c, ved at vælge indstillingen Lys på fanen Sporing og oprette en sort arenabaggrund. En albinomus på en sort baggrund opnår høj kontrast og giver bedre musesporing. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Det er vigtigt at justere tærsklen for musesporing. Tærsklen skal justeres på passende vis for at sikre god sporing af dyr under forsøget. Tærsklen justeres ved at flytte den røde linje i tærskelruden under fanen Fra kalibrator . (A) Et eksempel på et godt tærskelvalg med et udfyldt orange område og et blåt X på objektet. (B) En dårlig tærskel med plettet orange. Dårlig sporing fører til tab af et dyr i arenaen eller forhindrer musen i at modtage et chok, når det er i stødzonen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Sammenligning af præstation mellem unge (10 uger) og ældre (18 måneder) mus på et 5-dages læringsparadigme og Trace-kort. (A) De 10 uger gamle mus fik signifikant færre stød sammenlignet med de 18 måneder gamle mus i løbet af 5 dages testning; Bemærk, at forskellen i antallet af modtagne stød var minimal på den første testdag mellem grupperne, men unge mus med intakt hukommelse lærte at undgå at komme ind i chokzonen hurtigere end den ældre gruppe. (B) Den maksimale undgåelsestid blev beregnet som den maksimale tid, der blev brugt på at undgå chokket under forsøget på 10 minutter. De yngre mus lærte hurtigt at undgå at komme ind i chokzonen sammenlignet med ældre mus, hvilket tyder på, at de unge mus lærer effektivt. (C) Musen på dette sporkort modtog kun to stød, som repræsenteret af de to cirkler i dette erhvervelsesforsøg. Denne mus tilbragte også mere tid i arenaen overfor stødzonen, som er repræsenteret af den røde kile. (D) Denne mus fik flere stød og tilbragte mere tid tæt på stødzonen, hvilket tyder på, at rumlig indlæring ikke blev opnået i denne mus. Tovejs, gentaget foranstaltning ANOVA med Bonferroni post hoc test blev brugt til at teste signifikans. s<0.0001. Panelerne A og B blev modificeret fra Blackmore et ^al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Sporingskort giver vigtige oplysninger om hver mus under hvert forsøg. (A) Bemærk de lige linjer, der findes i dette eksempel på sporing. Dette skyldes, at sporingssoftwaren fejlagtigt identificerer en mus under opgaven. (B) Et eksempel på god sporing under retssagen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Spor visualisering og varmekort på forskellige dyresporingsprogrammer. Både (A) Program 1 og (B) Program 2 registrerer dyrets placering og bevægelse for at skabe sporplots for visuelt at inspicere, om dyret lærer opgaven eller effekten af eksperimentel behandling. Begge programmer viser identiske sporplots fra et dyr, der lærte opgaven effektivt. c) Der kan også oprettes et varmekort, som letter identifikationen af hotspots og klyngedannelse af datapunkterne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Afslutningsvis er den aktive stedundgåelsestest en effektiv rumlig læringsopgave, der kan bruges på en række musestammer og eksperimentelle forhold. APA-opgaven overvinder begrænsninger forbundet med andre rumlige læringsparadigmer¹⁴, såsom MWM, hvilket er stressende for musene målt ved kortisolniveauer⁹. MWM er også uegnet til ældre mus, hvor de er rapporteret at flyde under opgave¹⁰. Selvom andre rumlige læringstests, såsom Barnes-labyrinten og den nye objektplaceringstest, er mindre stressende, er de begrænset af, hvor ofte gentagne test kan udføres på den samme kohorte af mus. Derfor er den største fordel ved APA-opgaven, at den kan bruges flere gange, da flere parametre kan justeres for at opretholde nyhed. Faktisk har vi brugt APA-opgaven op til 5 gange på den samme kohorte af mus til at undersøge effekten af hippocampus ablation og den efterfølgende effekt af øvelse⁸. I hvert tilfælde blev parametrene, herunder arenarotation, stødzone og rumlige signaler, ændret mellem testene. Dette var effektivt til at sikre, at musene brugte rumlige navigationssignaler til at genlære opgaven, som det fremgår af kontroldyrene, der startede med et stort antal stød og derefter faldt i løbet af efterfølgende testdage for hver testperiode⁸. I slutningen af et 5-dages testparadigme mener vi typisk, at ethvert dyr, der modtog mere end 10 stød på den sidste dag eller har en maksimal undgåelse på mindre end 60 s, ikke har lært paradigmet.

Ud over muligheden for nemt at ændre indstillinger for at tillade flere runder af rumlig test sikrer APA-opgaven, at mus skal bruge rumlig navigation for effektivt at undgå stødzonen. For eksempel skal dyr bruge eksterne signaler til at lokalisere og undgå at komme ind i den stationære stødzone ved at navigere væk fra den⁵. Da arenaen roterer, er dyr ikke i stand til at bruge en idiotetisk tilgang til navigation, og de kan heller ikke bruge exteroceptive signaler såsom lugt, fordi disse signaler roterer med arenaen, mens chokzonen og rumlige signaler forbliver stationære⁵.

Det er også vigtigt at sikre, at mus er passende vant til forskeren og APA-arenaen. Intensiteten af fodstød skal også optimeres, da både for lav og for høj stødintensitet kan kompromittere mus' evne til at lære og udføre opgaven⁵. Stødintensiteten er typisk indstillet til 0,5 mA og bør ikke overstige 0,7 mA. For dyr, der har øget angstlignende adfærd, overveje at reducere både lysintensitet og fodstødintensitet. Øget angst under APA-opgaven kan vise sig som enten overdreven spring, ukontrolleret løb inden for arenaen eller langvarig frysning. Protokollen beskrevet her brugte en stødintensitet på 0,5 mA, den samme intensitet, som tidligere er blevet brugt med BALB / c, som vides at have højere angstlignende adfærd¹⁵.

Her beskriver vi dyresporingssoftwaren leveret af det firma, der leverede den aktive stedundgåelsesrig, der blev brugt. Alternativ video tracking software er også velegnet til at analysere adfærdsmæssige præstationer. Disse programmer kan også nøjagtigt måle og analysere musens ydeevne under APA-opgaver. Disse programmer tillader oprettelse af flere zoner og steder inden for APA-arenaen for at vurdere adfærd. Arenaindstillingen for en APA består af en trekantet stødzone, hvor antallet af indgange, tid til første indtrængen og tid brugt i stødzonen måles. Yderligere zoner kan også tilføjes inden for arenaen. For eksempel kan vi tilføje en central zone eller en zone modsat stødzonen for at måle den brugte tid og tilbagelagt afstand i disse zoner som en dyrestrategi for at undgå den aversive zone. Disse programmer sporer musens massecenter, som derefter gemmes og vises over referencerammen til visuel inspektion (figur 6A, B). Endelig er det også muligt at oprette et tæthedsvarmekort til individuel og gruppeydelse (figur 6C).

Når du udfører APA-opgaven, er der potentielle problemer, der skal løses. Nogle gange skal mus udelukkes fra analysen på grund af manglende respons på chokzonen. Som altid bør udelukkelse kun overvejes, når de opfylder foruddefinerede afvigende betingelser, for eksempel falder uden for 2 standardafvigelser fra gennemsnittet. Komplekse adfærdsmæssige opgaver som APA kræver typisk høje N-værdier af dyr. Vi foreslår, at du udfører en effektanalyse for at beregne den passende prøvestørrelse, før du udfører APA. Dette afhænger af den anvendte stamme og behandlingsgrupper. Erfaringen viser, at en n-værdi på 10 eller mere for hver gruppe giver tilstrækkelig effekt, når der udføres APA-eksperimenter. Hovedproblemet med denne opgave er at sikre sporing af musen af høj kvalitet under opgaven. Tilvænningsfasen af opgaven skal bruges til at bekræfte, at dette sker. Mus, der ikke reagerer på et stød, skyldes ofte scat mellem gitterstængerne. Det er derfor vigtigt at rengøre riggen efter hvert dyr og fjerne eventuel scat eller urin. Dette vil også reducere stresset for de dyr, der følger. APA-opgaven involverer typisk et 5-dages paradigme, hvilket kan give nogle begrænsninger for undersøgelser, der involverer interventioner, der er effektive mindre end 5 dage; Imidlertid kan korttidshukommelse eller rumlig læringserhvervelse stadig vurderes for sådanne undersøgelser ved hjælp af 30 min, enkeltsession-tilgangen.

Sammenfattende giver denne artikel en detaljeret beskrivelse af, hvordan man opsætter og bruger paradigmet for aktiv stedundgåelse til at teste musenes rumlige læring. Evnen til at ændre forholdene, så flere musestammer af varierende farve kan testes, er en klar fordel i forhold til andre, mere traditionelle rumlige tests såsom MWM. Endvidere giver modifikationen af flere parametre mulighed for gentagen testning, så ændringerne i rumlig læring kan sammenlignes nøjagtigt under forskellige eksperimentelle paradigmer eller under fysiologisk aldring. På kort tid har APA-testen vist sig at være et præcist og effektivt alternativ til hippocampusafhængig rumlig læring. I fremtiden kan APA-opgaven bruges som en pålidelig metode til vurdering af terapeutiske eller træningsinterventioner på kognitiv og rumlig adfærd hos både vildtype og transgene mus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Constant Current Source CS02	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Control Box	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Ethovision	Noldus	version 16	Wageningen, Netherlands
Shock Scrambler	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Track Analysis	BioSignal Group	version 2.2	Acton, Massachusetts, United States
Tracker Programme	BioSignal Group	version: 2.36	Acton, Massachusetts, United States