Summary
Här presenterar vi ett protokoll för testet för att undvika aktiv plats, ett hippocampus-beroende spatialt inlärningsparadigm designat för gnagare. Ändring av nyckelparametrar gör det möjligt att testa djuren på nytt före och efter behandlingar eller över tid.
Abstract
Hippocampus-beroende rumslig inlärning hos gnagare har testats med en mängd olika metoder. Dessa inkluderar Morris vattenlabyrint (MWM), Y-labyrint och nya objektlokaliseringsuppgifter (NOL). På senare tid har uppgiften att undvika aktiv plats (APA) utvecklats som ett alternativ till dessa mer traditionella metoder. I APA-uppgiften måste möss använda rumsliga signaler placerade runt en roterande arena för att undvika en stationär chockzon. På grund av de många parametrar som kan justeras har APA-uppgiften visat sig vara ett mycket mångsidigt tillvägagångssätt. Den lämpar sig för att användas longitudinellt och upprepade gånger för samma kohort av möss. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att framgångsrikt utföra APA-uppgiften. Vi lyfter också fram alternativa APA-metoder som kan användas för att undersöka olika komponenter i rumsligt lärande. Vi beskriver datainsamlings- och analysprocesserna. Kritiska steg under APA-uppgiften diskuteras för att öka sannolikheten för att testet ska kunna genomföras framgångsrikt. APA-uppgiften har flera fördelar jämfört med mer traditionella tester av rumslig navigering. Det är lämpligt att använda med åldrade möss eller de med sjukdomsfenotyper som Alzheimers sjukdom. Uppgiftens komplexitet kan enkelt ändras, vilket gör att ett brett spektrum av musstammar kan testas. Vidare är APA-uppgiften lämplig för att testa djur som har genomgått kirurgi eller experimentella ingrepp som kan ha påverkat motorisk eller neural funktion, såsom stroke eller traumatisk hjärnskada.
Introduction
Aktivt platsundvikande (APA) är ett effektivt verktyg för att testa hippocampus-beroende rumslig inlärning hos gnagare 1,2,3,4. Under APA-uppgiften placeras djuret på en roterande arena och måste använda visuella signaler för att orientera sig och undvika en motbjudande chockzon5. Rotationen av arenan säkerställer att musen inte kan använda ett idiotetiskt tillvägagångssätt för navigering, och inte heller kan doftmärken användas, eftersom dessa signaler roterar på plattformen medan chockzonen förblir stationär5. Genom att ändra hastigheten och riktningen på arenan, såväl som placeringen av chockzonen och visuella signaler, kan mössen testas på nytt flera gånger 6,7,8. APA erbjuder flera tydliga fördelar jämfört med Morris vattenlabyrint (MWM), ett av de mest använda testerna för rumslig inlärning. Det är viktigt att möss har en aversion mot att simma och tycker att MWM-uppgiften ärextremt stressande. Vidare har åldrade möss rapporterats flyta under MWM-uppgift10, vilket gör den olämplig som en rumslig inlärningsuppgift i många fall. Dessutom, eftersom MWM-uppgiften kräver en dold, nedsänkt plattform för mössen att lokalisera under testningen. Detta kräver att vattnet är ogenomskinligt, vilket vanligtvis uppnås genom tillsats av vit färg. Spårning och analys av djur under beteendemässiga uppgifter kräver tillräcklig kontrast mellan försöksperson och omgivning, vilket utesluter att vissa musstammar som Swiss eller BALB/c testas i MWM. I APA-uppgiften kringgås detta problem genom att svart plast läggs till under gallret.
Flera APA-paradigm har utformats för att testa rumslig inlärning, vilket visar dess användbarhet som ett effektivt beteendeverktyg. Till exempel åstadkoms förvärv, bevarande och konsolidering av rumslig inlärning vanligtvis genom dagliga tester av djur som kan variera från 3-5 dagar 6,7,11,12. Minne och inlärning kvantifieras genom att jämföra antalet stötar som mottagits varje förvärvsdag. Tid till första ingång och den maximala tiden för att undvika chockzonen är också viktiga parametrar som kan användas för att bestämma förändringar i inlärningsförmåga under uppgiften. Alternativt kan spatialt arbetsminne testas genom att genomföra en enda 30 minuters APA-session 2,13 där spatial inlärning mäts som förändringar inom sessionen genom att jämföra prestanda, såsom chocknummer, i 5 minuters bins.
I den här artikeln beskriver vi APA-uppgiften och lyfter fram de viktigaste funktionerna som måste beaktas när du genomför detta rumsliga inlärningstest.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av University of Queensland Animal Ethics Committee enligt riktlinjerna från National Health and Medical Research Council of Australia (godkännandenummer: QBI/189/15).
1. Inställning av APA-rum
OBS: APA-apparaten består av en upphöjd arena med ett metallgallergolv omslutet av en 32 cm hög transparent cirkulär gräns. Metallstängerna är jämnt fördelade (0,5 cm från varandra) och har 0,3 cm i diameter.
- Se till att APA-apparaten befinner sig inom kameraramen som är monterad i taket. Spåra musen med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara för djurspårning.
- APA-arenan roterar i allmänhet med 1 varv per minut, och en förutbestämd 60° stationär stötzon är inställd inom den roterande arenan. När musen går in i stötzonen, ge en mild fotstöt på 0,5 mA (60 Hz, 500 ms).
- Se till att platsen för stötzonen förblir konstant under provningen och ställs in elektroniskt inom experimentuppställningen. Den roterande arenan för musen in i chockzonen om inte musen aktivt rör sig för att undvika den.
- Placera fyra nya visuella ledtrådar på fyra olika rumsväggar på samma höjd som den roterande plattformen, vanligtvis 30-50 cm från arenan. Se till att ledtrådarna har neutrala färger, till exempel svartvita symboler eller former som är tryckta på A3-papper och laminerade för enkel rengöring (Figur 1A).
- Se till att ljusintensiteten i rummet är mellan 30-70 lux. Ökande ljusintensitet framkallar ångestliknande beteende och minskar utforskandet.
- Innan du börjar, öppna Tracker-programmet och välj APA-uppgiften.
- I Alternativ för Tracker 2D väljer du fliken Experiment . Se här till att Undvik plats – Endast en ram – Endast position är markerat. Detta gör det möjligt att konfigurera de parametrar som krävs. Spara konfigurationsfilen och justera efter behov.
- På fliken Experiment anger du experimentets varaktighet i rutan Experimenttid . En typisk experimentlängd är 600 s eller 10 min.
- Se till att Aktivera timer är markerad. Ändra chockparametrarna i timerområdet enligt beskrivningen ovan.
- Ange den vanliga experimentinformationen i utrymmet som finns i regionen Rumsram på fliken Experiment . Se till exempel till att standardutdatafilens namn är ifyllt med datumet, en enkel experimentell identifierare och testdagen. Avsluta namnet med ett understreck "_" för att tillåta att ett unikt mus-ID läggs till under experimentet.
- I området Rumsram finns även fliken Mål . Klicka på knappen Redigera för att ge möjlighet att se till att hela arenan ingår i det intressanta området. Välj sedan Arc för att tillhandahålla de justerbara parametrarna för storleken och platsen för stötmålzonen (Figur 1B).
- Öppna fliken Spårning för att justera parametrarna för att säkerställa framgångsrik musspårning. Kontrastboxen har antingen mörka eller ljusa alternativ för att tillåta både mörka (t.ex. C57Bl/6) eller ljusa (t.ex. BALB/c) möss. Detta skapar en effektiv kontrast mellan bakgrunden och mössen. När du använder albinostammar av möss, placera en bit svart plast under arenan för att möjliggöra denna kontrast (Figur 2).
- Ställ in mössens storlek och områdesintervall i den här regionen. Ställ in dessa parametrar för att effektivt känna igen musen när du är i arenan. Alternativt kan du ställa in dessa efter att ha tryckt på knappen Från kalibrator .
- Välj knappen Från kalibrator för att se till att arenan är helt i intresseområdet.
- Starta arenan på den här fliken för att se till att arenan finns kvar i masken när arenan roterar. Den här fliken är också viktig för att välja lämplig kontrasttröskel. Flytta den röda linjen i fönstret Tröskel för att justera kontrasttröskeln.
OBS: Figur 3A visar ett optimalt tröskelval, vilket framgår av ett fast orange område och ett blått "X" där musen är placerad. Ett dåligt tröskelvärde visas i figur 3B och visar endast fläckig orange och inget "X".
- Starta arenan på den här fliken för att se till att arenan finns kvar i masken när arenan roterar. Den här fliken är också viktig för att välja lämplig kontrasttröskel. Flytta den röda linjen i fönstret Tröskel för att justera kontrasttröskeln.
- Använd fliken Enheter och ställ in rotationsriktningen och hastigheten för arenan med hjälp av hastighetsknappen. Välj både positiva och negativa hastigheter, som representerar medurs och moturs rotationer. Ställ in stötintensiteten i avsnittet Aktuell källa . Den vanligaste inställningen för möss är 1 rpm rotation och en stöt på 0,5 mA.
- Ändra hur eller när stötarna ska utdelas på fliken Aktuell källa .
- Se till att Aktuellt läge är valt för Spåra beroende. Detta kommer att ge en elektrisk stöt när musen rör sig in i chockzonen.
- Välj Tid för att ge stötar med ett tidsintervall som ställts in av användaren. Använd tidigare inspelade spår för att chocka en mus genom att välja Från fil. Detta för att ge en okad kontrollmus som utsätts för ett identiskt antal stötar med samma varaktighet och intensitet oberoende av spatial inlärning.
OBS: Flikarna File Output (Filutdata ) och Fönster (Fönster) gör det möjligt att spara data och videofiler i en specifik katalog. Knappen Från bild på fliken Filutdata gör det också möjligt att välja det intressanta området för att fånga hela arenan.
- Dra dig tillbaka bakom ridån och påbörja rättegången. Försöksledarens närvaro i närheten av arenan och onödigt buller kan påverka djurens prestationer.
- Se till att eventuellt ljud och lukt är begränsat under försöket, vilket kan ge musen ytterligare en ledtråd, vilket påverkar deras prestanda. Exempel för att minimera detta är att se till att det finns en stängd behållare för kliniskt avfall, att använda rum som är avskilda från bullriga laboratorieutrymmen och att noggrant rengöra utrustningen mellan möss. Forskare kan överväga att använda generatorn för vitt brus för att maskera orelaterade externa ljud.
- Låt sängkläderna i hemburen förbli desamma under hela beteendetestperioden, eftersom det kan ge ny stimulans och påverka beteendet.
- För att undvika dygnsvariationer, utför tester vid en konsekvent tidpunkt varje dag.
2. Tillvänjning till hantering av experimenterare
- Hantera varje mus dagligen i 30 s till 1 minut i minst 2-3 dagar före testningen. Djurhantering minskar avsevärt stress och ångestrelaterat beteende under testning.
- Använd samma labbrock och undvik att bära starka deodoranter, cologne eller parfym under tillvänjningen och testningen.
3. Tillvänjning till APA-arenan (1 dag)
- Ta med musen in i förrummet eller testrummet för tillvänjning. Låt musen vänja sig i minst 30 minuter. Ställ in ljusintensiteten i förrummet eller testrummet innan mössen tas in för att vänja sig.
- Ställ in Tracker-programvaran.
- Skapa en experimentspecifik mapp. Beroende på det experimentella paradigmet kan du ha separata mappar för varje dag eller försök. Konfigurera experimentkonfigurationer enligt beskrivningen ovan och spara dessa konfigurationer för användning i framtiden.
- Innan du startar en provperiod öppnar du den sparade konfigurationen genom att klicka på fliken Arkiv , klickar sedan på Spara-symbolen , lägger till ett unikt mus-ID i det nyöppnade fönstret och kör testversionen genom att trycka på fliken Spela upp.
- Vänj musen vid APA-apparaten genom att utsätta den för den roterande arenan i 5 minuter utan att ge stötar.
- Ta bort musen från hemburen genom att lyfta den från svansens bas och försiktigt placera den på den handskbeklädda handen. Transportera musen till APA-apparaten och placera den på avstånd från stötzonen, vänd mot väggen.
- Dra dig tillbaka bakom ridån och påbörja rättegången.
- I slutet av testningen tar du bort musen och återgår till hemburen.
- Samla upp all urin och spillning och rengör gallret noggrant med 80 % (v/v) etanol.
- Upprepa steg 3.4-3.7 för alla möss.
4. Förvärvsutbildning med APA (1-6 dagar)
- Ställ in rumsbelysningen på identiska förhållanden som på tillvänjningsdagen.
- Ta med musen in i förrummet eller testrummet och låt den vänja sig i minst 30 minuter.
- Ställ in Tracker-programvaran enligt beskrivningen ovan.
- Ställ in varaktigheten för provperioden.
- Se till att strömkällan är på och inställd (dvs. 0.5 mA).
- Placera musen på arenan bort från chockzonen och vänd mot väggen.
- Dra dig tillbaka bakom ridån och börja provperioden genom att trycka på Play-knappen . Övervaka musen på datorskärmen och ingripa vid behov. Till exempel får musen inte stötar eller verkar överdrivet stressad, vilket framgår av överdrivet hoppande eller vokalisering.
- I slutet av testningen tar du bort musen och återgår till hemburen.
OBS: Se till att möss tar emot och reagerar på stötarna. Möss svarar på chocken genom att backa tillbaka och vokalisera. Om så inte är fallet kan det hända att de inte får stöten. Detta kan bero på scat på rutnätet eller på grund av otillräcklig spårning. Därför är det viktigt att rengöra rutnätet efter varje försök och optimera musspårningen, som diskuterats ovan.
5. Utbildning för förvärv av reversering (valfritt, 1-6 dagar)
- I omvändningsuppgiften, flytta stötzonen till en ny plats, vanligtvis 180° från den tidigare positionen. Bedöm musens förmåga att på ett flexibelt sätt lära sig en ny plats i stötzonen. Rumssignalerna ändras vanligtvis inte under omvändningsinlärning.
- Upprepa steg 3.4-3.7 för alla möss.
6. Sondförsök (valfritt, 1 dag)
- I sondförsöket, mät tiden till den första ingången och/eller den maximala tiden för att undvika chockzonen.
OBS: Detta indikerar minneskonsolidering efter förvärvsfasen. En vältränad mus undviker att gå in i chockzonen under en längre period (>60 sekunder), vilket visar tecken på rumslig inlärning. - Ställ in ljusstyrkan i rummet på samma sätt som på förvärvsträningsdagen.
- Vänj musen vid att vara i testrummet eller förrummet i 30 minuter.
- Ställ in Tracker-programvaran.
- Ställ in provperiodens varaktighet till samma tid som den testperiod som tidigare genomförts (till exempel 10 min eller 30 min, beroende på testparametrar).
- Ge inte stötar för denna rättegång.
- Placera musen på motsatt sida av den motbjudande chockzonen, vänd mot väggen.
- Starta rättegången och dra dig tillbaka bakom ridån.
- Se till att musen spåras effektivt.
- Övervaka musen på datorskärmen och stoppa provperioden när den kommer in i chockzonen. Vissa forskare föredrar att fortsätta försöket i 5 minuter för att se om musen fortsätter att återvända till chockzonen.
- Plocka försiktigt upp musen och återgå till hemburen.
- Se till att all urin och spillning samlas upp och att gallret rengörs noggrant med 80 % (v/v) etanol.
7. Spåra analys
OBS: Uppgiftens utförande kan uppnås via olika spårningsprogram. Nedan följer hur den medföljande programvaran används för att bestämma prestandan under APA-uppgiften. I det här fallet analyseras data med hjälp av programmet Spåranalys .
- För att analysera data, öppna programmet Spåranalys och välj Undvikande från rullgardinsmenyn i huvudfönstret.
- Klicka på Lägg till uppgift för att ladda upp datafilerna som sparats under förvärvsfasen i ett nytt fönster. I Gruppnamn skapar du en grupp som ska analyseras, t.ex. dag 1 eller tid för analys.
- Klicka på utdatakatalogen för att välja den plats där analyserade data ska sparas.
- Lägg till filerna som ska analyseras genom att klicka på fliken Lägg till filer och välja filerna från den lokala enheten.
- Ställ in tiden som ska analyseras genom att klicka på fliken Ställ in tid . Detta ger möjlighet att definiera den period som ska analyseras, dvs. 0 till 600 s. Alternativt kan du analysera data i lagerplatser, dvs. 60 s.
- När alla spår har lagts till klickar du på fliken Analys och väljer Kör analys för att analysera data. Analysen kommer att producera flera mappar. De data som ska analyseras kommer att finnas i mappen TBLfiles . Öppna dessa datafiler i ett kalkylblad och använd dem för vidare analys, t.ex. parvis jämförelse eller upprepade mätningar ANOVA.
OBS: Analysen kommer också att producera andra mappar, inklusive PS-filer som kommer att ha en ensidig beskrivning av mössen under testningen, som visar en spårkarta och var chockerna mottogs.
Representative Results
Möss med intakt spatial inlärningsförmåga kommer att visa en minskning av antalet chocker under på varandra följande förvärvsförsök (Figur 4A). På samma sätt kommer den maximala tiden för att undvika chockzonen att öka i takt med att musen lär sig att navigera bort från stötzonen (Figur 4B). Möss som inte kan lära sig en effektiv undvikande strategi kommer dock att uppvisa ett konstant antal chocker för varje förvärvsförsök (Figur 4A). Ofta kommer möss som inte lyckas identifiera chockzonen att få flera stötar under varje inträde i zonen. Spårningskartor är användbara för att ge exempel på möss som lär sig att undvika chockzonen (Figur 4C) och de som inte kan undvika chockzonen (Figur 4D). I båda fallen representerar dessa spårkartor den sista dagen för förvärvet. Musen i figur 4C fick bara 2 stötar, som representeras av de två cirklarna. Observera också att spårningskartan visar att musen tillbringar större delen av tiden på motsatt sida av stötzonen som representeras av den röda kilen. Omvänt fick musen i figur 4D fler stötar, och spårkartan visar ett oordnat mönster. Exempel på möss som inte lyckas lära sig att undvika chockzonen är de som har minskad hippocampus neurogenes antingen på grund av högre ålder, vilket visas av de 18 månader gamla mössen (Figur 4A,B- modifierad från Blackmore et al., 20217), kemisk ablation av omogna neuroner6 eller hippocampuslesioner (se Codd et al., 2020)8.
Det är viktigt att skilja mellan ett misslyckat försök på grund av att musen inte lär sig och ett fel i installationen av utrustningen. De två vanligaste orsakerna till dåliga resultat på grund av utrustningsfel är dålig spårning av musen (Figur 5A) eller att musen inte får en stöt. Dålig spårning kan förhindra att musen får en stöt när den är i chockzonen. Alternativt kan dålig spårning felaktigt framkalla en stöt när musen inte är i zonen. I båda fallen kommer detta att hindra musen från att utveckla en effektiv undvikande strategi. Dålig spårning kan lösas genom att justera tröskeln på fliken "Från kalibrator". Dålig spårning definieras vanligtvis som mer än 1000 dåliga bilder under en 10-minutersperiod och förekommer mycket sällan. Dålig spårning kan bli ett problem med åldrade möss, där alopeci kan utvecklas. När musen får en stöt kommer den att reagera antingen genom att spänna sig eller ibland vokalisera. Musen rör sig vanligtvis, om ens lite, och kan ses på livespårningsprogramvaran. När musen håller sig helt stilla inom stötzonen visas en tydlig linje av stötar (Figur 5B). Detta kan bero på att chockboxen inte är påslagen eller att scat har fastnat mellan stängerna, vilket minskar amplituden på stöten som levereras till djuret.
Figur 1: APA-apparat, beteenderum och inställning av stötzoner. (A) Ett exempel på testarenan och rumsuppställningen. APA-apparaten är upphöjd och placerad i mitten av rummet, omgiven av nya visuella ledtrådar. Svarta och vita visuella ledtrådar används på samma höjd som plattformen. (B). Målfunktionen på fliken Experiment gör det möjligt att maskera hela arenan och skapar en plats för chockzonen. En stötzon, representerad av den röda kilen, har skapats vid 270° i detta example. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: APA-inställning för albinomusstammar. APA-arenan kan ställas in för albinostammar av möss, till exempel BALB/c, genom att välja alternativet Ljus på fliken Spårning och skapa en svart arenabakgrund. En albinomus på en svart bakgrund uppnår hög kontrast och erbjuder bättre musspårning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Det är viktigt att justera tröskeln för musspårning. Tröskelvärdet måste justeras på lämpligt sätt för att säkerställa god spårning av djur under försöket. Tröskelvärdet justeras genom att flytta den röda linjen i tröskelrutan på fliken Från kalibrator . (A) Ett exempel på ett bra tröskelval med ett helorange område och ett blått X på objektet. (B) En dålig tröskel med spräcklig apelsin. Dålig spårning leder till att ett djur försvinner på arenan eller hindrar musen från att få en stöt när den befinner sig i chockzonen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Jämförelse av prestanda mellan unga (10 veckor) och äldre (18 månader) möss på ett 5-dagars inlärningsparadigm och Trace maps. (A) De 10 veckor gamla mössen fick signifikant färre chocker jämfört med de 18 månader gamla mössen under 5 dagars testning; Observera att skillnaden i antalet mottagna stötar var minimal mellan grupperna under den första testdagen, men unga möss med intakt minne lärde sig att undvika att komma in i chockzonen snabbare än den äldre gruppen. (B) Maximal undvikande tid beräknades som den maximala tid som ägnades åt att undvika chocken under 10-minutersförsöket. De yngre mössen lärde sig snabbt att undvika att hamna i chockzonen jämfört med äldre möss, vilket tyder på att de unga mössen lär sig effektivt. (C) Musen i denna spårningskarta fick endast två stötar, som representeras av de två cirklarna i detta förvärvsförsök. Den här musen tillbringade också mer tid i arenan mittemot chockzonen, som representeras av den röda kilen. (D) Den här musen fick fler stötar och tillbringade mer tid nära chockzonen, vilket tyder på att spatial inlärning inte uppnåddes hos den här musen. Tvåvägs, upprepad mätning ANOVA med Bonferroni post hoc-tester användes för att testa signifikans. s<0,0001. Panelerna A och B har modifierats från Blackmore et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Spårningskartor ger viktig information för varje mus under varje försök. (A) Lägg märke till de raka linjerna som finns i det här exemplet på spårning. Detta beror på att spårningsprogrammet felaktigt identifierar en mus under uppgiften. (B) Ett exempel på bra spårning under försöket. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Spårvisualisering och värmekarta på olika djurspårningsprogram. Både (A) Program 1 och (B) Program 2 detekterar djurets position och rörelse för att skapa spårdiagram för att visuellt inspektera om djuret lär sig uppgiften eller effekten av experimentell behandling. Båda programmen visar identiska spårdiagram från ett djur som lärt sig uppgiften effektivt. (C) En värmekarta kan också skapas, vilket underlättar identifiering av hotspots och klustring av datapunkterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Sammanfattningsvis är testet för undvikande av aktiv plats en effektiv rumslig inlärningsuppgift som kan användas på en mängd olika musstammar och experimentella förhållanden. APA-uppgiften övervinner begränsningar som är förknippade med andra paradigm för rumslig inlärning14, såsom MWM, som är stressande för mössen mätt med kortisolnivåer9. MWM är också olämplig för åldrade möss, där de har rapporterats flyta under uppgift10. Även om andra spatiala inlärningstester, som Barnes-labyrinten och novel object location test, är mindre stressande, är de begränsade av hur ofta upprepade tester kan utföras på samma kohort av möss. Därför är den största fördelen med APA-uppgiften att den kan användas flera gånger eftersom flera parametrar kan justeras för att upprätthålla nyheten. Faktum är att vi har använt APA-uppgiften upp till 5 gånger på samma kohort av möss för att undersöka effekten av hippocampusablation och den efterföljande effekten av träning8. I varje fall ändrades parametrarna, inklusive arenans rotation, chockzon och rumsliga ledtrådar, mellan testerna. Detta var effektivt för att säkerställa att mössen använde rumsliga navigeringssignaler för att lära sig uppgiften på nytt, vilket framgår av att kontrolldjuren började med ett stort antal stötar och sedan minskade under efterföljande testdagar för varje testperiod8. Vanligtvis, i slutet av ett 5-dagars testparadigm, anser vi att alla djur som fick mer än 10 stötar den sista dagen eller har en maximal undvikande på mindre än 60 s inte har lärt sig paradigmet.
Utöver möjligheten att enkelt ändra inställningar för att tillåta flera omgångar av rumslig testning, säkerställer APA-uppgiften att möss måste använda rumslig navigering för att effektivt undvika chockzonen. Till exempel måste djur använda externa signaler för att lokalisera och undvika att gå in i den stationära chockzonen genom att navigera bort från den5. Eftersom arenan roterar kan djuren inte använda ett idiotetiskt tillvägagångssätt för navigering, och de kan inte heller använda exteroceptiva signaler som lukt eftersom dessa signaler roterar med arenan medan chockzonen och de rumsliga signalerna förblir stationära5.
Det är också viktigt att se till att mössen är tillräckligt vana vid forskar- och APA-arenan. Intensiteten i fotstöten måste också optimeras, eftersom både för låg och för hög stötintensitet kan äventyra mössens förmåga att lära sig och utföra uppgiften5. Chockintensiteten är vanligtvis inställd på 0.5 mA och bör inte överstiga 0.7 mA. För djur som har ökat ångestliknande beteende, överväg att minska både ljusintensiteten och stötintensiteten i foten. Ökad ångest under APA-uppgiften kan visa sig som antingen överdrivet hoppande, okontrollerad löpning inom arenan eller långvarig frysning. Protokollet som beskrivs här använde en chockintensitet på 0,5 mA, samma intensitet som tidigare har använts med BALB/c, som är känt för att ha ett högre ångestliknande beteende15.
Här beskriver vi den programvara för djurspårning som tillhandahålls av företaget som tillhandahöll den aktiva riggen för undvikande av aktiv plats som användes. Alternativ programvara för videospårning är också lämplig för att analysera beteendemässiga prestationer. Dessa program kan också noggrant mäta och analysera musens prestanda under APA-uppgifter. Dessa program gör det möjligt att skapa flera zoner och platser inom APA-arenan för att bedöma beteendet. Arenans inställning för en APA består av en triangulär chockzon, där antalet ingångar, tid till första inträde och tid som tillbringas i chockzonen mäts. Ytterligare zoner kan också läggas till inom arenan. Vi kan till exempel lägga till en central zon eller en zon mittemot chockzonen för att mäta den tid som spenderas, och tillryggalagd sträcka i dessa zoner som en djurstrategi för att undvika den motbjudande zonen. Dessa program spårar musens tyngdpunkt, som sedan sparas och visas ovanför referensramen för visuell inspektion (Figur 6A,B). Slutligen är det också möjligt att skapa en densitetsvärmekarta för individuell och gruppprestation (Figur 6C).
När APA-uppgiften utförs finns det potentiella problem som måste åtgärdas. Ibland måste möss uteslutas från analysen på grund av att de inte svarar på chockzonen. Som alltid bör uteslutning endast övervägas när de uppfyller fördefinierade avvikande villkor, till exempel om de faller utanför 2 standardavvikelser från medelvärdet. Komplexa beteendeuppgifter som APA kräver vanligtvis höga N-värden hos djur. Vi föreslår att du genomför en effektanalys för att beräkna lämplig provstorlek innan du genomför APA. Detta beror på vilken stam som används och behandlingsgrupper. Av erfarenhet finner vi att ett n-värde på 10 eller mer för varje grupp ger tillräcklig effekt när man utför APA-experiment. Det största problemet med den här uppgiften är att säkerställa högkvalitativ spårning av musen under uppgiften. Tillvänjningsstadiet av uppgiften bör användas för att bekräfta att detta sker. Möss som inte svarar på en stöt beror ofta på spillning mellan gallerstängerna. Det är därför viktigt att rengöra riggen efter varje djur och ta bort eventuell spillning eller urin. Detta kommer också att minska stressen för djuren som följer efter. APA-uppgiften omfattar vanligtvis ett 5-dagarsparadigm, vilket kan innebära vissa begränsningar för studier som involverar interventioner som är effektiva mindre än 5 dagar; Korttidsminnet eller inlärningen av spatial inlärning kan dock fortfarande bedömas för sådana studier med hjälp av en 30 minuter lång metod med en enda session.
Sammanfattningsvis ger den här artikeln en detaljerad beskrivning av hur man ställer in och använder paradigmet för att undvika aktiv plats för att testa den rumsliga inlärningen hos möss. Möjligheten att ändra förhållanden så att flera musstammar av olika färg kan testas är en klar fördel jämfört med andra, mer traditionella spatiala tester som MWM. Dessutom möjliggör modifieringen av flera parametrar upprepade tester så att förändringarna i rumslig inlärning kan jämföras exakt under olika experimentella paradigm eller under fysiologiskt åldrande. På kort tid har APA-testet visat sig vara ett exakt och effektivt alternativ för hippocampus-beroende rumslig inlärning. I framtiden kan APA-uppgiften användas som en tillförlitlig metod för att bedöma terapeutiska eller träningsinterventioner på kognitivt och rumsligt beteende hos både vildtypsmöss och transgena möss.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Queensland Brain Institute (QBI) Animal Behaviour Facility för utvecklingen och underhållet av den apparat som beskrivs i detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
References
- Cimadevilla, J. M., Fenton, A. A., Bures, J. Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats. Neurosci Lett. 285 (1), 53-56 (2000).
- Willis, E. F., Bartlett, P. F., Vukovic, J. Protocol for short- and longer-term spatial learning and memory in mice. Front Behav Neurosci. 11, 197 (2017).
- Blackmore, D. G., Brici, D., Walker, T. L. Protocol for three alternative paradigms to test spatial learning and memory in mice. STAR Protoc. 3 (3), 101500 (2022).
- Pastalkova, E., et al. Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP. Science. 313 (5790), 1141-1144 (2006).
- Stuchlik, A., et al. Place avoidance tasks as tools in the behavioral neuroscience of learning and memory. Physiol Res. 62 (Suppl 1), S1-S19 (2013).
- Vukovic, J., et al. Immature doublecortin-positive hippocampal neurons are important for learning but not for remembering. J Neurosci. 33 (15), 6603-6613 (2013).
- Blackmore, D. G., et al. An exercise "sweet spot" reverses cognitive deficits of aging by growth-hormone-induced neurogenesis. iScience. 24 (11), 103275 (2021).
- Codd, L. N., Blackmore, D. G., Vukovic, J., Bartlett, P. F. Exercise reverses learning deficits induced by hippocampal injury by promoting neurogenesis. Sci Rep. 10 (1), 19269 (2020).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behav Brain Res. 198 (1), 247-251 (2009).
- van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C., Gage, F. H. Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice. J Neurosci. 25 (38), 8680-8685 (2005).
- Zhou, X. A., et al. Neurogenic-dependent changes in hippocampal circuitry underlie the procognitive effect of exercise in aging mice. iScience. 24 (12), 103450 (2021).
- Leinenga, G., Gotz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 278ra33 (2015).
- Willis, E. F., et al. Repopulating microglia promote brain repair in an IL-6-dependent manner. Cell. 180 (5), 833-846 (2020).
- Lesburgueres, E., Sparks, F. T., O'Reilly, K. C., Fenton, A. A. Active place avoidance is no more stressful than unreinforced exploration of a familiar environment. Hippocampus. 26 (12), 1481-1485 (2016).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
