APA-testen (Active Place Avoidance), en effektiv, allsidig og repeterbar romlig læringsoppgave for mus

Summary

Her presenterer vi en protokoll for aktiv stedsunngåelsestest, et hippocampus-avhengig romlig læringsparadigme designet for gnagere. Endring av nøkkelparametere gjør det mulig å re-teste dyr før og etter behandlinger eller over tid.

Abstract

Hippocampus-avhengig romlig læring hos gnagere har blitt testet ved hjelp av en rekke metoder. Disse inkluderer Morris vannlabyrint (MWM), Y-labyrint og nye objektlokaliseringsoppgaver (NOL). Mer nylig har oppgaven med å unngå aktive steder (APA) blitt utviklet som et alternativ til disse mer tradisjonelle tilnærmingene. I APA-oppgaven må mus bruke romlige signaler plassert rundt en roterende arena for å unngå en stasjonær sjokksone. På grunn av de mange parametrene som kan justeres, har APA-oppgaven vist seg å være en svært allsidig tilnærming. Den egner seg til å bli brukt i lengderetningen og gjentatte ganger for samme kohort av mus. Her gir vi en detaljert protokoll for å kunne utføre APA-oppgaven. Vi fremhever også alternative APA-tilnærminger som kan brukes til å undersøke ulike komponenter i romlig læring. Vi beskriver prosessene for datainnsamling og analyse. Kritiske trinn under APA-oppgaven diskuteres for å øke sannsynligheten for vellykket gjennomføring av testen. TFO-oppgaven har flere fordeler i forhold til mer tradisjonelle romlige navigasjonstester. Det er hensiktsmessig å bruke med eldre mus eller de med sykdomsfenotyper som Alzheimers sykdom. Kompleksiteten i oppgaven kan enkelt endres, slik at et bredt spekter av musestammer kan testes. Videre er APA-oppgaven egnet for testing av dyr som har gjennomgått kirurgi eller eksperimentelle inngrep som kan ha påvirket motorisk eller nevral funksjon, for eksempel hjerneslag eller traumatisk hjerneskade.

Introduction

Active place avoidance (APA) er et effektivt verktøy for å teste hippocampus-avhengig romlig læring hos gnagere 1,2,3,4. Under APA-oppgaven plasseres dyret på en roterende arena og må bruke visuelle signaler for å orientere seg og unngå en aversiv sjokksone⁵. Rotasjonen av arenaen sikrer at musen ikke kan bruke en idiotetisk tilnærming til navigering, og det kan heller ikke brukes duftmerker, da disse signalene roterer på plattformen mens sjokksonen forblir stasjonær⁵. Endring av arenaens hastighet og retning, samt plasseringen av sjokksonen og visuelle signaler, gjør det mulig å teste mus flere ganger ^6,7,8. APA tilbyr flere forskjellige fordeler sammenlignet med Morris vannlabyrint (MWM), en av de mest brukte romlige læringstestene. Det er viktig at mus har en aversjon mot svømming og synes MWM-oppgaven er ekstremt stressende⁹. Videre har eldre mus blitt rapportert å flyte under MWM-oppgaven¹⁰, noe som gjør den uegnet som en romlig læringsoppgave i mange tilfeller. Videre, ettersom MWM-oppgaven krever en skjult, nedsenket plattform for musene å finne under testing. Dette krever at vannet er ugjennomsiktig, noe som vanligvis oppnås ved tilsetning av hvit maling. Sporing og analyse av dyr under atferdsoppgaver krever tilstrekkelig kontrast mellom motiv og omgivelser, unntatt visse musestammer som sveitsisk eller BALB / c fra å bli testet i MWM. I TFO-oppgaven omgås dette problemet ved tilsetning av svart plast under rutenettet.

Flere APA-paradigmer er designet for å teste romlig læring, og demonstrerer nytten som et effektivt atferdsverktøy. For eksempel oppnås anskaffelse, oppbevaring og konsolidering av romlig læring vanligvis ved daglig testing av dyr som kan variere fra 3-5 dager 6,7,11,12. Hukommelse og læring kvantifiseres ved å sammenligne antall sjokk mottatt hver anskaffelsesdag. Tid til første inngang og maksimal tid for å unngå sjokksonen er også viktige parametere som kan brukes til å bestemme endringer i læringsevne under oppgaven. Alternativt kan romlig arbeidsminne testes ved å gjennomføre en enkelt, 30 min APA-økt ^2,13 hvor romlig læring måles som endringer i økten ved å sammenligne ytelse, for eksempel sjokknummer, i 5 min bins.

I denne artikkelen beskriver vi APA-oppgaven og fremhever nøkkelfunksjonene som må vurderes når du utfører denne romlige læringstesten.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av University of Queensland Animal Ethics Committee i henhold til retningslinjene fra National Health and Medical Research Council of Australia (godkjenningsnummer: QBI/189/15).

1. Oppsett av APA-rom

MERK: APA-apparatet består av en forhøyet arena med et metallgittergulv omsluttet av en 32 cm høy gjennomsiktig sirkulær grense. Metallstengene er jevnt fordelt (0,5 cm fra hverandre) og har en diameter på 0,3 cm.

1. Forsikre deg om at APA-apparatet er innenfor kamerarammen som er montert i taket. Spor musen ved hjelp av kommersielt tilgjengelig dyresporingsprogramvare.
2. APA-arenaen roterer vanligvis med 1 o / min-hastighet, og en forhåndsutpekt 60 ° stasjonær sjokksone er satt innenfor den roterende arenaen. Når musen kommer inn i sjokksonen, gir du et mildt fotstøt på 0,5 mA (60 Hz, 500 ms).
3. Forsikre deg om at plasseringen av sjokksonen forblir konstant under testingen og er satt elektronisk i det eksperimentelle oppsettet. Den roterende arenaen fører musen inn i sjokksonen med mindre musen aktivt beveger seg for å unngå det.
4. Plasser fire nye visuelle signaler på fire forskjellige romvegger i samme høyde som den roterende plattformen, vanligvis 30-50 cm fra arenaen. Kontroller at signalene er nøytrale farger, for eksempel svart-hvitt-symboler eller former som er trykt på A3-papir og laminert for enkel rengjøring (figur 1A).
5. Sørg for at lysintensiteten i rommet er mellom 30-70 lux. Økende lysintensitet induserer angstlignende oppførsel og reduserer leting.
6. Før du starter, åpner du Tracker-programmet og velger APA-oppgaven.
7. I Alternativer for sporing 2D velger du Eksperiment-fanen . Her må du sørge for at Place Avoidance- One Frame- Position Only er valgt. Dette vil tillate konfigurering av parametrene som kreves. Lagre konfigurasjonsfilen og juster etter behov.
8. I kategorien Eksperiment angir du eksperimentvarigheten i Eksperimenttidspunkt-boksen . En typisk eksperimentvarighet er 600 s eller 10 min.
9. Forsikre deg om at Aktiver tidtaker er valgt. Endre støtparameterne i Timer-området som beskrevet ovenfor.
10. Skriv inn de vanlige eksperimentelle detaljene i området Romramme i kategorien Eksperiment . Kontroller for eksempel at navnet på standard utdatafil fylles ut med datoen, en enkel eksperimentell identifikator og testdagen. Fullfør navnet med et understrekingstegn "_" for å tillate at du legger til en unik muse-ID under eksperimentet.
11. I området Romramme er også Mål-fanen . Klikk på Rediger-knappen for å gi muligheten til å sikre at hele arenaen er inkludert i interesseområdet. Velg deretter Arc for å angi de justerbare parametrene for størrelsen og plasseringen av sjokkmålsonen (figur 1B).
12. Åpne fanen Sporing for å justere parametrene for å sikre vellykket sporing av mus. Kontrastboksen har enten mørke eller lyse alternativer for å tillate både mørke (f.eks. C57Bl/6) eller lyse (f.eks. Dette skaper en effektiv kontrast mellom bakgrunnen og musene. Når du bruker albinostammer av mus, plasser et stykke svart plast under arenaen for å tillate at denne kontrasten oppnås (figur 2).
13. Angi musens størrelse og arealområder i denne regionen. Still inn disse parametrene for effektivt å gjenkjenne musen når du er på arenaen. Alternativt kan du stille inn disse etter å ha trykket på Fra kalibrator-knappen .
14. Velg Fra kalibrator-knappen for å sikre at arenaen er fullstendig i området for interessemasken.
    1. Start arenaen i denne fanen for å sikre at arenaen forblir i masken når arenaen roterer. Denne kategorien er også viktig for å velge riktig kontrastterskel. Flytt den røde linjen i Terskelverdi-ruten for å justere kontrastterskelen.
       MERK: Figur 3A viser et optimalt terskelvalg, noe som gjenspeiles av en solid oransje region og en blå "X" der musen er plassert. En dårlig terskel er vist i figur 3B og viser bare flekkete oransje og ingen "X".
15. Bruk kategorien Enheter og angi arenaens rotasjonsretning og hastighet ved hjelp av hastighetsknappen. Velg både positive og negative hastigheter, som representerer rotasjoner med urviseren og mot klokken. Angi støtintensiteten i delen Gjeldende kilde . Den vanligste innstillingen for mus er 1 rpm rotasjon og et 0,5 mA støt.
16. Endre hvordan eller når støtdemperne skal leveres i kategorien Gjeldende kilde .
    1. Kontroller at Gjeldende modus er valgt for å Spor avhengig. Dette vil gi et elektrisk støt når musen beveger seg inn i sjokksonen.
    2. Velg Tid for å gi sjokk ved et tidsintervall som er angitt av brukeren. Bruk tidligere innspilte spor til å sjokkere en mus ved å velge Fra fil. Dette er for å gi en åket kontrollmus utsatt for et identisk antall støt i samme varighet og intensitet uavhengig av romlig læring.
       MERK: Fanene Filutdata og Vindu tillater at data og videofiler lagres i en bestemt katalog. Fra bilde-knappen i kategorien Filutdata lar også interesseområdet fange hele arenaen som skal velges.
17. Trekk deg tilbake bak gardinen og begynn rettssaken. Eksperimentørens tilstedeværelse nær arenaen og unødvendig støy kan påvirke dyrets ytelse.
18. Sørg for at støy og lukt er begrenset under prøveperioden, noe som kan gi musen et annet signal som påvirker ytelsen. Eksempler for å minimere dette inkluderer å sikre en lukket klinisk avfallsbeholder, bruke rom fjernet fra støyende laboratorierom og grundig rengjøre utstyret mellom mus. Forskere kan vurdere å bruke den hvite støygeneratoren til å maskere ikke-relaterte eksterne lyder.
19. La hjemmebursengetøyet forbli det samme gjennom hele atferdstestperioden, da dette kan gi ny stimulering og påvirke atferden.
20. For å unngå daglige variasjoner, utfør testing på et konsekvent tidspunkt hver dag.

2. Habituation til eksperimentell håndtering

1. Håndter hver mus daglig i 30 s til 1 min i minst 2-3 dager før testingen. Dyrehåndtering reduserer stress og angstrelatert atferd betydelig under testing.
2. Bruk samme laboratoriefrakk og unngå å bruke sterke deodoranter, colognes eller parfyme under habituation og testing.

3. Tilvenning til TFO-arenaen (1 dag)

1. Ta musen inn i forværelset eller prøverommet for tilvenning. La musen venne seg i minst 30 minutter. Still inn lysintensiteten i forværelset eller testrommet før mus bringes inn for å venne seg.
2. Sett opp Tracker-programvaren.
   1. Opprett en eksperimentspesifikk mappe. Avhengig av det eksperimentelle paradigmet, har separate mapper for hver dag eller prøveversjon. Konfigurer eksperimentkonfigurasjoner som beskrevet ovenfor, og lagre disse konfigurasjonene for bruk i fremtiden.
   2. Før du starter en prøveversjon, åpner du den lagrede konfigurasjonen ved å klikke på Fil-fanen, deretter klikker du på Lagre-symbolet , legger til en unik muse-ID i det nyåpnede vinduet og kjører prøveversjonen ved å trykke på Play-fanen .
3. Habituate musen til APA-apparatet ved å utsette den for den roterende arenaen i 5 minutter uten å levere støt.
4. Fjern musen fra hjemmeburet ved å løfte den fra halens base og forsiktig plassere den på den hanskede hånden. Transporter musen til APA-apparatet og plasser den vekk fra sjokksonen, vendt mot veggen.
5. Trekk deg tilbake bak gardinen og begynn rettssaken.
6. På slutten av testingen, fjern musen og gå tilbake til hjemmeburet.
7. Samle all urin og katt, og rengjør risten grundig med 80% (v / v) etanol.
8. Gjenta trinn 3.4-3.7 for alle mus.

4. Anskaffelsestrening ved bruk av APA (1-6 dager)

1. Sett rombelysningen til identiske forhold som på tilvenningsdagen.
2. Ta musen inn i forrommet eller prøverommet og la den venne seg i minimum 30 minutter.
3. Konfigurer Tracker-programvaren som beskrevet ovenfor.
4. Angi varigheten for prøveversjonen.
5. Forsikre deg om at gjeldende kilde er på og satt (dvs. 0,5 mA).
6. Plasser musen på arenaen vekk fra sjokksonen og vendt mot veggen.
7. Trekk deg tilbake bak gardinen og begynn prøveperioden ved å trykke på Play-knappen . Overvåk musen på dataskjermen og grip inn om nødvendig. For eksempel mottar musen ikke støt eller virker altfor stresset, noe som fremgår av overdreven hopping eller vokalisering.
8. På slutten av testingen, fjern musen og gå tilbake til hjemmeburet.
   MERK: Forsikre deg om at mus mottar og reagerer på støtene. Mus reagerer på sjokket ved å rygge tilbake og vokalisere. Hvis dette ikke er tilfelle, kan det hende at de ikke får sjokket. Dette kan skyldes scat på nettet eller på grunn av utilstrekkelig sporing. Derfor er det viktig å rengjøre rutenettet etter hvert forsøk og optimalisere musesporingen, som diskutert ovenfor.

5. Opplæring i reversanskaffelse (valgfritt, 1-6 dager)

1. I reverseringsoppgaven flytter du sjokksonen til et nytt sted, vanligvis 180° fra forrige posisjon. Vurder musens evne til fleksibelt å lære en ny sjokksoneplassering. Romsignalene endres vanligvis ikke under reverseringslæring.
2. Gjenta trinn 3.4-3.7 for alle mus.

6. Prøveversjon av sonde (valgfritt, 1 dag)

1. I sondeforsøket måles tiden til første inngang og/eller maksimal tid for å unngå sjokksonen.
   MERK: Dette indikerer minnekonsolidering etter anskaffelsesfasen. En godt trent mus vil unngå å komme inn i sjokksonen i en lengre periode (>60 sekunder), noe som viser bevis på romlig læring.
2. Still inn lysintensiteten i rommet som på anskaffelsestreningsdagen.
3. Habituate musen i prøverommet eller forrommet i 30 min.
4. Sett opp Tracker-programvaren.
5. Sett prøvevarigheten til samme tid som testperioden som ble utført tidligere (for eksempel 10 min eller 30 min, avhengig av prøveparametere).
6. Ikke gi støt for denne studien.
7. Plasser musen på motsatt side av den aversive sjokksonen, vendt mot veggen.
8. Start rettssaken og trekk deg tilbake bak forhenget.
9. Forsikre deg om at musen spores effektivt.
10. Overvåk musen på dataskjermen og stopp prøveperioden når den kommer inn i sjokksonen. Noen forskere foretrekker å fortsette forsøket i 5 minutter for å se om musen fortsetter å gå tilbake til sjokksonen.
11. Ta forsiktig opp musen og gå tilbake til hjemmeburet.
12. Sørg for at all urin og scat er samlet, og risten er grundig rengjort med 80% (v / v) etanol.

7. Spor analyse

MERK: Utførelsen av oppgaven kan oppnås via annen sporingsprogramvare. Nedenfor ser du hvordan den medfølgende programvaren brukes til å bestemme ytelsen under APA-oppgaven. I dette tilfellet analyseres dataene ved hjelp av Sporanalyse-programmet .

1. For å analysere dataene, åpne Track Analysis-programmet og velg Unngåelse fra rullegardinmenyen i hovedvinduet.
2. Klikk på Legg til oppgave for å laste opp datafilene som ble lagret i anskaffelsesfasen i et nytt vindu. I Gruppenavn oppretter du en gruppe som skal analyseres, for eksempel dag 1 eller analysetidspunkt.
3. Klikk på utdatakatalogen for å velge plasseringen for å lagre de analyserte dataene.
4. Legg til filene som skal analyseres ved å klikke på fanen Legg til filer og velge filene fra den lokale stasjonen.
5. Angi tiden som skal analyseres, ved å klikke kategorien Angi tid . Dette gir muligheten til å definere perioden som skal analyseres, dvs. 0 til 600 s. Alternativt kan du analysere dataene i søppelkasser, det vil si 60 s.
6. Når alle sporene er lagt til, klikker du på Analyse-fanen og velger Kjør analyse for å analysere dataene. Analysen vil produsere flere mapper. Dataene for analyse vil være i TBLfiles-mappen . Åpne disse datafilene i et regneark og bruk dem til videre analyse, det vil si parvis sammenligning eller gjentatte målinger ANOVA.
   MERK: Analysen vil også produsere andre mapper, inkludert PS-filer som vil ha en enkeltsides beskrivelse av musene under testing, som viser et sporingskart og hvor støtene ble mottatt.

Representative Results

Mus med intakt romlig læringsevne vil vise en nedgang i antall sjokk under suksessive oppkjøpsforsøk (figur 4A). På samme måte vil den maksimale tiden det tar å unngå sjokksonen øke etter hvert som musen lærer å navigere bort fra sjokksonen (figur 4B). Imidlertid vil mus som ikke klarer å lære en effektiv unngåelsesstrategi, vise et konstant antall sjokk for hvert oppkjøpsforsøk (figur 4A). Ofte vil mus som ikke klarer å identifisere sjokksonen motta flere støt under hver inngang i sonen. Sporkart er nyttige for å gi eksempler på mus som lærer å unngå sjokksonen (figur 4C) og de som ikke klarer å unngå sjokksonen (figur 4D). I begge tilfeller representerer disse sporkartene den siste dagen for innsamlingen. Musen i figur 4C fikk bare 2 støt, representert ved de to sirklene. Vær også oppmerksom på at sporingskartet viser at musen tilbringer mesteparten av tiden på motsatt side av sjokksonen som er representert av den røde kilen. Omvendt fikk musen i figur 4D flere støt, og sporkartet avslører et uordnet mønster. Eksempler på mus som ikke klarer å lære å unngå sjokksonen er de som har redusert hippocampal neurogenese enten på grunn av høy alder, som vist av de 18 måneder gamle musene (figur 4A,B- modifisert fra Blackmore et al., 2021⁷), kjemisk ablasjon av umodne nevroner⁶ eller hippocampuslesjoner (se Codd et al., 2020)⁸.

Det er viktig å skille mellom en mislykket prøve på grunn av at musen ikke klarer å lære i motsetning til en feil i oppsettet av utstyret. De to vanligste årsakene til dårlige resultater på grunn av utstyrssvikt er dårlig sporing av musen (figur 5A) eller at musen ikke får støt. Dårlig sporing kan forhindre at musen får støt når den er i sjokksonen. Alternativt kan dårlig sporing indusere et støt når musen ikke er i sonen. I begge tilfeller vil dette forhindre musen i å utvikle en effektiv unngåelsesstrategi. Dårlig sporing kan løses ved å justere terskelen i fanen "Fra kalibrator". Dårlig sporing defineres vanligvis som mer enn 1000 dårlige bilder i løpet av en periode på 10 minutter, og forekommer svært sjelden. Dårlig sporing kan bli et problem med eldre mus, hvor alopecia kan utvikle seg. Når du mottar et støt, vil musen reagere enten ved å spenne eller til tider vokalisere. Musen vil vanligvis bevege seg, om til og med litt, og kan sees på live tracking-programvaren. Når musen holder seg helt stille innenfor sjokksonen, vises en klar linje med støt (figur 5B). Dette kan skyldes at støtboksen ikke er slått på eller scat fast mellom stengene, noe som reduserer amplituden til støtet som leveres til dyret.

Figur 1: APA-apparat, atferdsrom og sjokksoneinnstilling. (A) Et eksempel på testarena og romoppsett. APA-apparatet er forhøyet og plassert i midten av rommet, omgitt av nye visuelle signaler. Visuelle signaler i svart-hvitt brukes i samme høyde som plattformen. (B). Målfunksjonen i Eksperiment-fanen tillater maskering av hele arenaen og oppretter en plassering av sjokksonen. En sjokksone, representert av den røde kilen, er opprettet ved 270° i dette eksemplet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: APA-oppsett for albinomusestammer. APA-arenaen kan settes opp for albinostammer av mus, for eksempel BALB/c, ved å velge alternativet Lys i kategorien Sporing og opprette en svart arenabakgrunn. En albinomus på svart bakgrunn oppnår høy kontrast og gir bedre musesporing. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Det er viktig å justere terskelen for musesporing. Terskelen må justeres hensiktsmessig for å sikre god dyresporing under forsøket. Terskelverdien justeres ved å flytte den røde linjen i terskelruten i kategorien Fra kalibrator . (A) Et eksempel på et godt terskelvalg med en heltrukket oransje region og en blå X på objektet. (B) En dårlig terskel med flekkete oransje. Dårlig sporing fører til tap av et dyr i arenaen eller forhindrer at musen får støt når den er i sjokksonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Sammenligning av ytelse mellom unge (10 uker) og eldre (18 måneder) mus på et 5-dagers læringsparadigme og sporingskart. (A) De 10 uker gamle musene fikk betydelig færre støt sammenlignet med de 18 måneder gamle musene i løpet av 5 dager med testing; Merk at forskjellen i antall mottatte støt var minimal på den første testdagen mellom gruppene, men unge mus med intakt minne lærte å unngå å komme inn i sjokksonen raskere enn den eldre gruppen. (B) Maksimal tid unngåelse ble beregnet som maksimal tid brukt på å unngå støtet i løpet av 10 minutters prøveperiode. De yngre musene lærte raskt å unngå å komme inn i sjokksonen sammenlignet med eldre mus, noe som tyder på at de unge musene lærer effektivt. (C) Musen i dette sporkartet fikk bare to støt, representert ved de to sirklene i dette oppkjøpsforsøket. Denne musen brukte også mer tid på arenaen motsatt sjokksonen, som er representert av den røde kilen. (D) Denne musen fikk flere støt og tilbrakte mer tid nær sjokksonen, noe som tyder på at romlig læring ikke ble oppnådd i denne musen. Toveis, gjentatt måling ANOVA med Bonferroni post hoc-tester ble brukt for å teste signifikans. s<0.0001. Panel A og B ble modifisert fra Blackmore et ^al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Sporingskart gir viktig informasjon for hver mus under hvert forsøk. (A) Legg merke til de rette linjene som finnes i dette sporingseksemplet. Dette skyldes at sporingsprogramvaren feilaktig identifiserer en mus under oppgaven. (B) Et eksempel på god sporing under forsøket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Sporvisualisering og varmekart på forskjellige dyresporingsprogrammer. Både (A) Program 1 og (B) Program 2 registrerer dyrets plassering og bevegelse for å lage sporplott for å visuelt inspisere om dyret lærer oppgaven eller effekten av eksperimentell behandling. Begge programmene viser identiske sporplott fra et dyr som lærte oppgaven effektivt. (C) Et varmekart kan også opprettes, noe som letter identifiseringen av hotspots og klynging av datapunktene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Avslutningsvis er den aktive stedsunngåelsestesten en effektiv romlig læringsoppgave som kan brukes på en rekke musestammer og eksperimentelle forhold. APA-oppgaven overvinner begrensninger knyttet til andre romlige læringsparadigmer¹⁴, for eksempel MWM, som er stressende for musene målt ved kortisolnivåer⁹. MWM er også uegnet for eldre mus, hvor de har blitt rapportert å flyte under oppgaven¹⁰. Selv om andre romlige læringstester, som Barnes-labyrinten og den nye objektplasseringstesten, er mindre stressende, er de begrenset av hvor ofte gjentatt testing kan utføres på samme kohorte av mus. Derfor er den største fordelen med APA-oppgaven at den kan brukes flere ganger, da flere parametere kan justeres for å opprettholde nyheten. Faktisk har vi brukt APA-oppgaven opptil 5 ganger på samme kohort av mus for å undersøke effekten av hippocampus-ablasjon og den påfølgende effekten av trening⁸. I hvert tilfelle ble parametrene, inkludert arenarotasjon, sjokksone og romlige signaler, endret mellom testene. Dette var effektivt for å sikre at musene brukte romlige navigasjonssignaler for å lære oppgaven på nytt, som det fremgår av kontrolldyrene, som startet med et høyt antall støt og deretter avtok i løpet av påfølgende testdager for hver testperiode⁸. Vanligvis, på slutten av et 5-dagers testparadigme, anser vi at ethvert dyr som mottok mer enn 10 støt på den siste dagen eller har en maksimal unngåelse på mindre enn 60 s, ikke har lært paradigmet.

Utover muligheten til enkelt å endre innstillinger for å tillate flere runder med romlig testing, sikrer APA-oppgaven at mus må bruke romlig navigasjon for effektivt å unngå sjokksonen. For eksempel må dyr bruke eksterne signaler for å lokalisere og unngå å komme inn i den stasjonære sjokksonen ved å navigere bort fra den⁵. Når arenaen roterer, kan ikke dyr bruke en idiotetisk tilnærming til navigering, og de kan heller ikke bruke eksteroseptive signaler som lukt fordi disse signalene roterer med arenaen mens sjokksonen og romlige signaler forblir stasjonære⁵.

Det er også viktig å sikre at mus er riktig vant til forskeren og TFO-arenaen. Intensiteten av fotstøt må også optimaliseres, da både for lav og for høy støtintensitet kan kompromittere musens evne til å lære og utføre oppgaven⁵. Støtintensiteten er vanligvis satt til 0,5 mA og bør ikke overstige 0,7 mA. For dyr som har økt angstlignende oppførsel, bør du vurdere å redusere både lysintensitet og fotstøtintensitet. Økt angst under APA-oppgaven kan presentere seg som enten overdreven hopping, ukontrollert løping i arenaen eller langvarig frysing. Protokollen beskrevet her brukte en sjokkintensitet på 0,5 mA, samme intensitet som tidligere har blitt brukt med BALB / c, som er kjent for å ha høyere angstlignende oppførsel¹⁵.

Her beskriver vi dyresporingsprogramvaren levert av selskapet som leverte den aktive stedsunngåelsesriggen som ble brukt. Alternativ videosporingsprogramvare er også egnet for å analysere atferdsytelse. Disse programmene kan også måle og analysere museytelse nøyaktig under APA-oppgaver. Disse programmene tillater opprettelse av flere soner og steder innenfor APA-arenaen for å vurdere atferd. Arenainnstillingen for en APA består av en trekantet sjokksone, hvor antall innganger, tid for å først komme inn og tid brukt i sjokksonen måles. Ytterligere soner kan også legges til i arenaen. For eksempel kan vi legge til en sentral sone eller en sone overfor sjokksonen for å måle tiden brukt og avstanden som er reist i disse sonene som en dyrestrategi for å unngå den aversive sonen. Disse programmene sporer musesenteret for masse, som deretter lagres og vises over referanserammen for visuell inspeksjon (figur 6A, B). Endelig er det også mulig å lage et tetthetsvarmekart for individuell og gruppeytelse (figur 6C).

Når du utfører APA-oppgaven, er det potensielle problemer som må løses. Noen ganger må mus utelukkes fra analysen på grunn av manglende respons på sjokksonen. Som alltid bør utelukkelse bare vurderes når de oppfyller forhåndsdefinerte utliggervilkår, for eksempel faller utenfor 2 standardavvik fra gjennomsnittet. Komplekse atferdsoppgaver som APA krever vanligvis høye N-verdier av dyr. Vi foreslår at du gjennomfører en effektanalyse for å beregne riktig prøvestørrelse før du utfører APA. Dette vil avhenge av belastningen som brukes og behandlingsgruppene. Av erfaring finner vi at en n-verdi på 10 eller mer for hver gruppe gir tilstrekkelig kraft når man gjennomfører APA-eksperimenter. Hovedproblemet med denne oppgaven er å sikre sporing av musen av høy kvalitet under oppgaven. Tilvenningsfasen av oppgaven bør brukes til å bekrefte at dette skjer. Mus som ikke reagerer på et støt skyldes ofte scat mellom gitterstengene. Det er derfor viktig å rengjøre riggen etter hvert dyr og fjerne eventuell scat eller urin. Dette vil også redusere stresset for dyrene som følger. APA-oppgaven innebærer vanligvis et 5-dagers paradigme, som kan presentere noen begrensninger for studier som involverer intervensjoner som er effektive mindre enn 5 dager; Imidlertid kan korttidshukommelse eller romlig læringsoppkjøp fortsatt vurderes for slike studier ved hjelp av 30 min, enkeltøkttilnærming.

Oppsummert gir denne artikkelen en detaljert beskrivelse av hvordan du konfigurerer og bruker paradigmet for å unngå aktivt sted for å teste romlig læring av mus. Evnen til å endre forholdene slik at flere musestammer av varierende farge kan testes, er en klar fordel i forhold til andre, mer tradisjonelle romlige tester som MWM. Videre tillater modifikasjonen av flere parametere gjentatt testing slik at endringene i romlig læring kan sammenlignes nøyaktig under ulike eksperimentelle paradigmer eller under fysiologisk aldring. På kort tid har APA-testen vist seg å være et nøyaktig og effektivt alternativ for hippocampus-avhengig romlig læring. I fremtiden kan APA-oppgaven brukes som en pålitelig metode for å vurdere terapeutiske eller treningsintervensjoner på kognitiv og romlig oppførsel i både villtype og transgene mus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Constant Current Source CS02	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Control Box	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Ethovision	Noldus	version 16	Wageningen, Netherlands
Shock Scrambler	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Track Analysis	BioSignal Group	version 2.2	Acton, Massachusetts, United States
Tracker Programme	BioSignal Group	version: 2.36	Acton, Massachusetts, United States