Summary
Protokollet använder avancerad light-sheet-mikroskopi tillsammans med anpassade vävnadsrensningsmetoder för att undersöka intrikata hjärtstrukturer i gnagarhjärtan, vilket har stor potential för förståelsen av hjärtats morfogenes och remodellering.
Abstract
Light-sheet-mikroskopi (LSM) spelar en central roll för att förstå den intrikata tredimensionella (3D) strukturen i hjärtat, vilket ger viktiga insikter om grundläggande hjärtfysiologi och patologiska svar. Vi fördjupar oss härmed i utvecklingen och implementeringen av LSM-tekniken för att belysa hjärtats mikroarkitektur i musmodeller. Metodiken integrerar ett skräddarsytt LSM-system med vävnadsrensningstekniker, vilket minskar ljusspridning i hjärtvävnad för volymetrisk avbildning. Kombinationen av konventionell LSM med bildsammanfogning och multiview-dekonvolutionsmetoder gör det möjligt att fånga hela hjärtat. För att ta itu med den inneboende kompromissen mellan axiell upplösning och synfält (FOV) introducerar vi dessutom en axiellt svept light-sheet-mikroskopimetod (ASLM) för att minimera oskarpt ljus och jämnt belysa hjärtat över utbredningsriktningen. Under tiden förbättrar vävnadsrensningsmetoder som iDISCO ljusgenomträngningen, vilket underlättar visualiseringen av djupa strukturer och säkerställer en omfattande undersökning av myokardium i hela hjärtat. Kombinationen av de föreslagna LSM- och vävnadsrensningsmetoderna utgör en lovande plattform för forskare när det gäller att lösa upp hjärtstrukturer i gnagarhjärtan, vilket har stor potential för förståelsen av hjärtats morfogenes och remodellering.
Introduction
Hjärtsvikt är fortfarande den vanligaste dödsorsaken i världen, främst på grund av bristen på regenerativ kapacitet hos mogna kardiomyocyter1. Hjärtats intrikata arkitektur spelar en avgörande roll för dess funktion och ger insikter i utvecklingsprocesser. En djup förståelse av hjärtats struktur är avgörande för att belysa de grundläggande processerna för hjärtats morfogenes och remodellering som svar på hjärtinfarkt. Nya framsteg har visat att neonatala möss kan återställa hjärtfunktionen efter skada, medan vuxna möss saknar sådan regenerativ kapacitet2. Detta skapar en grund för att undersöka signaler associerade med strukturella och funktionella abnormiteter i musmodeller. Traditionella avbildningsmetoder, såsom konfokalmikroskopi, har tekniska begränsningar, inklusive begränsat penetrationsdjup, långsamt punktskanningsschema och fotoskador från långvarig exponering för laserljus. Dessa hindrar en omfattande tredimensionell (3D) avbildning av det intakta hjärtat. I detta sammanhang framstår light-sheet-mikroskopi (LSM) som en kraftfull lösning, som erbjuder fördelarna med höghastighetsavbildning, minskade fotoskador och exceptionella optiska snittningsmöjligheter 3,4,5. De unika egenskaperna hos LSM positionerar den som en lovande metod för att övervinna begränsningarna hos konventionella tekniker, vilket ger oöverträffade insikter i hjärtutveckling och ombyggnadsprocesser 6,7,8.
I det här protokollet introducerar vi en avbildningsstrategi som kombinerar avancerad LSM med anpassade vävnadsrensningsmetoder9, vilket möjliggör avbildning av hela mushjärtan utan behov av specifik märkning och mekanisk snittning. Vi föreslår vidare att konventionell LSM-avbildning kan förbättras genom multiview deconvolution10 eller axiellt svept light-sheet mikroskopi (ASLM) tekniker 11,12,13,14,15 för att förbättra axiell upplösning. Dessutom kan integreringen av bildsammanfogning med någon av dessa metoder effektivt övervinna kompromissen mellan rumslig upplösning och synfält (FOV), och därigenom främja avbildningen av vuxna mushjärtan. Inkorporeringen av många vävnadsrensningsmetoder, inklusive hydrofoba, hydrofila och hydrogelbaserade metoder, möjliggör djupare ljuspenetration för att fånga morfologin i hela hjärtat 16,17,18,19.
Även om flera clearingmetoder är kompatibla med nuvarande LSM-system, är målet att minimera fotonspridning och förbättra ljuspenetrationen i vävnader, som hjärtat, genom att ersätta lipider med ett medium som nära matchar dess brytningsindex. iDISCO valdes som representant20,21 och anpassades för autofluorescensavbildning i detta protokoll på grund av dess snabba bearbetning och höga transparens (Figur 1A). Sammantaget erbjuder integrationen av den avancerade LSM-metoden med vävnadsrensningstekniker ett lovande ramverk för att reda ut intrikata hjärtanatomier i gnagarhjärtan, vilket har en betydande potential för att främja vår förståelse av hjärtats morfogenes och patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprotokoll och experiment har godkänts och utförts under överinseende av University of Texas at Dallas Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC #21-03). C57BL6-möss, inklusive nyfödda på postnatal dag 1 (P1) och 8 veckor gamla vuxna, användes i denna studie. Ingen skillnad observerades mellan hanar och honor. All datainsamling och efterbehandling av bilder utfördes med hjälp av programvara med öppen källkod eller plattformar med forsknings- eller utbildningslicenser. Resurserna är tillgängliga från författarna på rimlig begäran.
1. Provberedning och vävnadsrensning (6 - 10 dagar)
- Förbered alla kemiska lösningar i Materialförteckningen som krävs för vävnadsrensningsmetoden innan du påbörjar vävnadsrensningsproceduren.
OBS: Utför alla procedurer i ett dragskåp medan du bär lämplig personlig skyddsutrustning, särskilt vid hantering av giftiga kemikalier. - Avliva djur med CO2 genom att placera dem i en CO2 -kammare vid önskade tidpunkter, såsom P1 och 8 veckor, för insamling av hela hjärtat och sänk ner det nyligen isolerade hjärtat vid rumstemperatur (RT) i 0,2 M KCl för att arrestera i diastole16.
- Fixera hjärtat genom att sänka ner i 4 % paraformaldehyd (PFA) i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med försiktig omrörning på en vippa över natten för att bevara hjärtats anatomi vid 4 °C, se tabell 1.
VARNING: PFA är en giftig kemikalie och bör utföras under ett dragskåp. - Tvätta hjärtat med 1x PBS vid RT i 30 min, 3x.
OBS: Valfritt: Bädda in hjärtat i agarosgel för att skapa en hjärtenhet för det specialbyggda LSM-systemet i steg 2 enligt beskrivningen nedan.- Bered den 1% agaroslösningen genom att lösa upp agaros i PBS och värm blandningen i mikrovågsugnen tills den är helt upplöst. Häll lösningen i en form för att skapa ett bottenskikt tills lösningen svalnar till 40 °C.
- Lägg hjärtat i formen och fyll formen med agarosgel tills den stelnar. Eliminera eventuella bubblor i agarosgelen för att minimera artefakter i avbildningen.
OBS: Att bädda in sample minskar risken för potentiell skada på hjärtats anatomi under monteringen.
VARNING: Använd agaros med låg smältpunkt och undvik att placera hjärtat direkt i uppvärmd agaros för att minska risken för att utsätta sample för förhöjda temperaturer.
- Dehydrera hjärtat med hjälp av gradienter av metanol blandat med avjoniserat vatten (Figur 1B), bearbeta genom sekventiella koncentrationer på 20 %, 40 %, 60 %, 80 % och 100 % enligt beskrivningen i tabell 1. Upprepa med färsk 100 % metanol 1x för att säkerställa fullständig uttorkning. Torka ut neonatala mushjärtan i 1 timme i varje metanolblandning med skakning. Justera inkubationstiden till 2 timmar för 8 veckor gamla mushjärtan och råtthjärtan.
VARNING: Metanol är en flyktig, irriterande och brandfarlig kemikalie. - Byt ut och kyl hjärtat med färsk 100 % metanol i 10 minuter vid 4 °C.
- Byt ut lösningen och blek hjärtat med 5 % väteperoxid (H2O2) i metanol med ett volymförhållande på 1:5 (30 % H2O2 till 100 % metanol) över natten vid 4 °C för att avlägsna pigmenten.
OBS: Avlägsnandet av pigment gör det möjligt att minimera absorptionen av fotoner, vilket leder till förbättrad bildkvalitet med minskade artefakter. - Byt ut lösningen och inkubera hjärtat i 100% metanol i 1 timme vid RT.
- Delipidisera hjärtat med lösningen som innehåller 66 % diklormetan (DCM) och 33 % metanol i 3 timmar med skakning. Se till att hjärtat sjunker till botten av injektionsflaskan i slutet av detta steg. Om inte, förnya lösningen (66 % DCM / 33 % metanol) och förläng inkubationstiden (t.ex. 1 timme till) för att uppnå full delipidering. Överför hjärtat till en ny lösning snabbt för att förhindra uttorkning, eftersom DCM är mycket flyktigt.
VARNING: Använd polypropen eller glas för experimentet, eftersom DCM inte är kompatibelt med polystyren. - Använd dibensyleter (DBE) för matchning av brytningsindex (RI = 1,56). För neonatala mushjärtan tar processen för matchning av brytningsindex 2 dagar, medan det för 8 veckor gamla mushjärtan tar 5 dagar med milda skakningar. Byt ut den mot ny DBE och förläng inkubationstiden tills hjärtat uppnår fullständig transparens.
VARNING: DBE är farligt. Undvik all kontakt med huden.
2. Provmontering (1 dag)
OBS: Om ett kommersiellt LSM-system används, följ dess specifika protokoll som tillhandahålls av företaget för att fixa hjärtat och hoppa över steg 2.1 - 2.9.
- Anpassa en kammare och en hållare som är resistent mot matchningslösningen för brytningsindex (t.ex. DBE i den anpassade iDISCO-metoden) med hjälp av en 3D-skrivare och Onyx-material (Figur 2A)16.
- Fäst en magnet i botten av kammaren för att underlätta snabb anslutning och korrekt lokalisering under LSM-systemet (Figur 2B).
- Fäst 25 mm x 50 mm x 0,17 mm täckglas på kammaren med genomskinligt silikonlim och verifiera kammarens vattentäta integritet genom att fylla den med DBE och kontrollera om det finns läckor efter 1 dag.
- Anpassa en klämhållare med hjälp av en 3D-skrivare och fäst en magnet för att montera hjärtenheten inuti kammaren (Figur 2C) eller sätt in en nål i agarosgelen för montering av hjärtenheten.
- Genomföra utvecklingen av ett internt LSM-system med hjälp av en cylindrisk lins och kontinuervågsdiodpumpade solid-state (DPSS) lasrar som tidigare rapporterats16,22. Använd excitationsvåglängden 532 nm för att fånga autofluorescens från myokardium (Figur 2D).
- Montera kammaren på ett 6-dimensionellt steg och lokalisera den optimala positionen där kammaren är vinkelrät mot laserutbredningsriktningen.
- Använd en magnetisk klämhållare för att placera provet i mitten av kammaren och anslut hållaren till en 4-dimensionell motoriserad stage (X, Y, Z och Yaw; Figur 2D).
- Sänk ner hjärtenheten i kammaren fylld med DBE med hjälp av det motoriserade steget och bestäm skanningsområdet längs detektionsaxeln (Z-riktning).
- Bestäm motorns skanningshastighet (Vz) längs Z-riktningen baserat på stegstorleken (S) och insamlingstiden för en bild (T) med hjälp av följande ekvation:
OBS: Förhållandet mellan stegstorleken och den axiella upplösningen hos avbildningssystemet följer Nyquist-Shannons samplingsteorem. Till exempel sattes stegstorleken till 1 μm, med tanke på att den axiella upplösningen var 2,91 μm, som anges i den tidigare rapporten16. - För att verifiera den rumsliga upplösningen och minimera potentiella opacitetsproblem på olika djup, mät systemets punktspridningsfunktion (PSF) genom att avbilda fluorescerande pärlor med diametern 0,53 μm utspädda i 1 % agarosgel med låg smältpunkt med en koncentration på 1:1,5 x 105. Beräkna polyesterstapelfibrerna för hela provet genom att mäta hela bredden vid halva maximum (FWHM)16.
3. Bildsömnad (4-8 h)
- Beräkna antalet brickor som krävs för att täcka hela mushjärtat, med tanke på det begränsade synfältet. För varje ruta motsvarar dimensionerna synfältet för LSM-systemet. Till exempel kräver ett neonatalt mushjärta med ett tvärsnittsmått på 3 x 3,6 mm2 2 plattor för täckning i den anpassade LSM (figur 3A). Däremot kräver ett 8 veckor gammalt mushjärta som mäter 5 x 8 mm2 3 x 4 plattor för att täcka hela hjärtstrukturen (figur 3B).
OBS: Bildsömmar krävs om den konventionella LSM har begränsad FOV för avbildning av hela hjärtat. - Ta bilder av hjärtat med början från bricka 1, dvs. det övre vänstra hörnet av hjärtat (Figur 3A-B).
- Ta sekventiella bilder av de återstående brickorna med 10 % överlappning mellan på varandra följande brickor tills hela hjärtat är täckt, som illustreras i figur 3C.
- Ladda ner och installera Fiji23 programvara med öppen källkod. Ladda ner och installera Fiji-pluginet, BigStitcher24.
- Navigera till Hjälp-menyn, välj Uppdatera, välj Hantera uppdateringswebbplats och välj BigStitcher. Klicka sedan på Stäng, följt av Tillämpa ändringar. När du är klar med nedladdningen av plugin-programmet startar du om Fiji-programvaran.
- Öppna plugin-programmet BigStitcher och importera alla nödvändiga brickor via bildfilskatalogen. Spara datauppsättningen som en HDF5-fil.
- Organisera brickor genom att välja Flytta bricka med vanligt rutnät, välj det mönster som används för att flytta hjärtat och välj en överlappning på 10 % mellan varje ruta. Sy ihop brickorna med alternativet Stitching Wizard.
- Exportera sammanfogade data med Image Fusion för att generera en tiff-fil.
4. Multiview deconvolution (5 dagar)
- Använd fluorescerande pärlor för bildregistrering av multiview-rekonstruktion längs hjärtat (Figur 3D).
- Bered harts25 genom att blanda bisfenol-A-diglycidyleter (D.E.R. 332), isoforondiamin, 5-amino-1,3,3-trimetylcyklohexametylamin (IPDA) och polypropenglykoldiglycidyleter (D.E.R 736) i ett volymförhållande på 4:1:1.
- Centrifugera 10 μL fluorescenspärlor vid 161 x g i 5 minuter och tillsätt 20 μL metanol för att ersätta lagringslösningen av pärlorna. Upprepa det 3 gånger.
- Bered en 10 ml lösning med en koncentration av 1:1 x 105 pärlor genom att blanda den metanolbaserade pärllösningen i det harts som beretts i steg 4.1.1.
- Avgasa lösningen i en vakuumkammare i 3 timmar för att avlägsna luftfickor och bubblor.
- Häll lösningen i en silikonform eller ett sugrör av plast och vänta i 2 till 3 dagar tills den stelnar. Efter 1 dag innan hartset blir fast, sätt glasröret inuti formen och vänta tills röret fäster på hartset. Ta bort hartset från formen med glasröret (Figur 3D).
- Placera hjärtat i glasröret, fyll det med DBE och montera glasröret i kammaren fylld med DBE.
- Ta sekventiella bilder av mushjärtat tillsammans med pärlorna från den upplysta delen genom att skanna hjärtenheten över detekteringsaxeln (Z-axeln; Figur 3E-F).
OBS: Implementera bildsammanfogning i steg 3 för att generera enskilda högar med bilder om hjärtstorleken överstiger synfältet. - Rotera musens hjärta 60° längs Y-axeln för att fånga efterföljande staplar från flera vinklar, dvs. 0°, 60°, 120°, 180°, 240° och 300° (Figur 3E-F).
- Öppna plugin-programmet BigStitcher och importera alla bilder via bildfilskatalogen. Spara datauppsättningen som en HDF5-fil.
- Välj Upptäck intressepunkter och välj manuellt pärlor av intresse för registrering.
- Välj Affin transformeringsmodell för registrering. Välj Point Spread Function och tilldela PSF till alla vyer.
- Klicka på Multiview Deconvolution och välj typ av iteration som Efficient Bayesian. Definiera Antal iterationer som 10 och kör det26.
- Klicka på Image Fusion för att exportera en tiff-fil .
OBS: Mer detaljerad information om multiview-faltningen finns i andra rapporter eller protokoll 24,27,28.
5. Hårdvara för axiellt sopade lätta ark (1 dag)
- Installera en elektrisk avstämbar lins (ETL) på Fourierplanet på den cylindriska linsen (CL)27 (Figur 2D) för att skanna laserstrålen axiellt14. Se till att vätskegränssnittet i ETL är horisontellt för att förhindra vågfrontsförvrängning orsakad av gravitationen. Rikta in ETL exakt för att minimera stråldecentrering och optiska aberrationer av högre ordning30.
- Installera ett DAQ-kort i arbetsstationen och anslut en BNC-kabel till DAQ-kortet för att synkronisera kameraexponering och ETL-skanning.
- Öppna höljet till ETL-drivrutinen och ta bort locket (Figur 4).
- Löd signalkabeln från BNC-kabeln till det analoga in B-stiftet, enligt märkningen på undersidan av kretskortet (figur 4).
- Löd jordledningen på BNC-kabeln till GND-stiftet; anslut sedan den andra änden av BNC-kabeln till AO (Analog Output) på DAQ-kortet (Figur 4).
- Anslut ETL-drivrutinen till USB-porten på arbetsstationen, anslut drivrutinen till ETL med en hirose-kabel och installera Lens Driver Controller Software.
- Ändra driftläge i Lens Driver Controller Software till Analog för att styra ETL med en utlösare som genereras från DAQ-kortet.
- I programvaran för sCMOS-kameran, växla inspelningsläge till Extern (Light-sheet). Se till att den aktiva pixelskanningsriktningen är vinkelrät mot laserskanningsriktningen för att underlätta synkroniseringen.
- Anslut den externa triggerporten på baksidan av sCMOS-kameran till AO på DAQ-kortet med en BNC-kabel (Figur 4).
6. Synkronisering av ljusarkssystemet med axiellt svepning (7 dagar)
- Definiera exponeringstiden baserat på det acceptabla signal-till-bakgrundsförhållandet (SBR) som för den föreslagna studien är minst 10. Öka exponeringstiden om SBR är lägre än 10.
OBS: Exponeringstid från 10 till 50 ms ger en acceptabel SBR i detta projekt. - Definiera exponeringstiden för en bild (T) och linjeintervallet (L) baserat på exponeringstiden (E) för kameran och ETL-frekvensen (f) med hjälp av följande ekvationer:
Där P anger antalet pixelkolumner på kamerasensorn. De representativa parametrarna för referensen är f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms respektive L = 243 μs. - I LabVIEW-programmet Trigger Generator.vi genererar både kvadratiska och triangla triggers för synkronisering (figur 5).
OBS: Det anpassade LabVIEW-programmet är tillgängligt från författarna på rimlig begäran. - Montera fluorescerande pärlor utspädda i 1 % agarosgel16 med låg smältpunkt med en koncentration på 1:1 x 103 för att lokalisera positionen för strålens midja i bilden (Figur 6A).
- I programmet identifierar du start- och slutpunkterna för laserstrålen under synfältet genom att ändra spänningen längs skanningsriktningen.
- Om du vill synkronisera sCMOS-kameran och ETL skannar du laserstrålen längs X-axeln och aktiva pixlar längs Y-axeln för att generera en 2D-bild (figur 6B). De ljusare och skarpare pärlorna längs diagonalen i bilden indikerar den exakta synkroniseringen mellan sCMOS och ETL.
OBS: Synkroniseringen av skanningshastigheten för ETL- och sCMOS-pixelaktivering är avgörande för bildkvaliteten. Olika vanliga asynkrona fel sammanfattas i figur 6C-F. - Efter att ha bestämt optimala synkroniseringsparametrar för synkronisering, rotera sCMOS-kameran 90° runt Z-axeln för att justera den aktiva pixelriktningen med laserskanningsriktningen.
- Upprepa steg 2.10 och mät FWHM för PSF. Använd samma metod som anges i föregående rapport16, med de genomsnittliga laterala och axiella upplösningarna för ASLM som 2,18 μm respektive 2,88 μm (figur 7).
OBS: Enhetlig belysning och upplösning över hela synfältet är genomförbart under idealiska förhållanden (Figur 7A-B). Asynkron drift av ETL med sCMOS-kameran, liksom felinriktning av belysning och detektering, kan resultera i ojämn rumslig upplösning (Figur 7C-D). - För hjärtavbildning, efter att ha justerat systemet och bestämt de optimala parametrarna för systemsynkronisering, fortsätt med steg 2.6 till 2.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LSM har visat sig främja hjärtstudier 31,32,33,34,35,36,37 på grund av den minimala risken för fotoskador, hög rumslig upplösning och optisk snittning i motsats till andra optiska avbildningsmetoder som ljusfält och punktskanningstekniker 6,8,38,39,40 . Således, för att bättre förstå 3D-myokardarkitekturen, har vi etablerat protokollet baserat på primära metoder inklusive anpassad iDISCO-rensning, bildsammanfogning, multiview-dekonvolution och ASLM. Även om vi presenterade resultat med hjälp av musmodeller är det viktigt att notera att råttor och andra gnagarmodeller också är lämpliga för de föreslagna metoderna. Det anpassade vävnadsrensningsprotokollet gör det möjligt att göra P1-mushjärtat genomskinligt inom 4 dagar och det 8 veckor gamla mushjärtat genomskinligt inom 7 dagar (Figur 1B). Detta steg fungerar som en utgångspunkt för att minimera absorption och spridning av fotoner i det intakta hjärtat. Multiview-dekonvolution gör det möjligt att förbättra axiell upplösning genom att sammanfoga bilder från flera perspektiv till en enda modell. Efter att sekventiellt ha registrerat bilder från 6 vyer av samma hjärta, uppnår multiview-dekonvolutionsmetoden nästan isotrop upplösning med en lateral på 4,68 μm och en axiell på 5,06 μm, efter 15 timmars beräkning (figur 8A). För att undvika den beräkningsmässiga komplexiteten anpassade vi ytterligare en ETL-baserad ASLM för att avbilda från neonatala till vuxna mushjärtan. Denna metod gör det möjligt för oss att skanna myokardium med en tätt fokuserad laserstråle, vilket minimerar den oskarpa bakgrunden och förbättrar bildkontrasten jämfört med de konventionella LSM-metoderna (figur 8B). Med den nuvarande ASLM-designen uppnår de genomsnittliga laterala och axiella upplösningarna för systemet 2,18 μm respektive 2,88 μm, vilket möjliggör djupgående utforskning av myokardtrabekulering i ventriklar. Dessutom kan bildsammanfogning användas oberoende av varandra, eller i kombination med multiview-dekonvolution eller ASLM för att utöka synfältet för större provstorlekar. Genom att integrera sömmar med ASLM kan vi täcka hela det 8 veckor gamla mushjärtat med enhetlig upplösning (figur 8C), vilket ger en effektiv lösning för att undersöka tvärsnittet av hela hjärtat.
Figur 1: Vävnadsrensningsprocess. (A) Den hydrofoba metoden omfattar vävnadsuttorkning, lipidextraktion och matchning av brytningsindex med användning av dibensyleter (DBE) som organiskt lösningsmedel. (B) Sänk ner hjärtat i en blandning av 4 % formaldehydlösning (PFA) och dehydratisera det med en gradient av blandningar av metanol och avjoniserat (DI) vatten. Blek hjärtat med 5 % H2O2 i metanol vid 4 °C. Delipidisera hjärtat med diklormetan (DCM) och metanollösning tills provet sjunker till botten av röret. Slutligen inkuberas hjärtat i DBE för att få det önskade brytningsindexet. Rutnätslinjer 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk bild av axiellt svept light-sheet-mikroskopi. (A) Anpassad 3D-printad kammare, (B) kammarmagnet, (C) klämhållare och (D) ASLM-system. Förkortningar: CL: cylindrisk lins; ETL: elektronisk avstämbar lins; IL: belysning lins; DL: detektion lins; FW: filterhjul; TL: rör lins. Denna siffra har modifierats från Ref16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bildsammanfogning och multiview-faltning. (A-B) Bildsammanfogning används för att täcka hela mushjärtan, där varje ruta har en 10 % synfältsöverlappning med sina intilliggande rutor. (C) Rörelsemönster för mushjärtat för bildsammanfogning. (D) Fluorescerande pärlor är fästa i änden av glasröret för att underlätta bildregistrering, medan hjärtat är placerat inuti glasröret som innehåller DBE, vilket möjliggör samtidig avbildning av både mushjärtat och fluorescerande pärlor. (E) Multiview-dekonvolution innebär förvärv av bilder från sex distinkta perspektiv, som var och en samlar bilder från unika riktningar. (F) Rådata för P1-mushjärta och pärlor i olika vinklar på 0°, 60°, 120°, 180°, 240° och 300°. Skalstänger: 500 μm. Denna siffra har ändrats från16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Blockdiagram över ASLM-systemet. Använda DAQ-kort för synkronisering av ETL- och sCMOS-kamera. Höljet till ETL-drivrutinen har öppnats för lödning av signal- och jordledningar till kretskortet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5: LabView-kontrollpanelen. LabVIEW kontrollpanel för att generera triggers för att synkronisera ETL och aktiverade pixlar i sCMOS-kameran. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Synkronisera fokus för light-sheet med aktiverade pixlar. (A) Identifieringen av start- och slutpunkterna för light-sheet-skanningsområdet uppnås genom att konfigurera lämplig spänning för ETL-utlösaren. (B) Det synkrona resultatet av fluorescerande pärlor är tydligt längs bildens diagonal. (C–F) Den ojämna rumsliga upplösningen över hela synfältet beror på den asynkrona driften av ETL med sCMOS-kameran. ETL:en initierar genomsökning (C) senare eller (D) tidigare än den aktiverade pixeln. (E-F) Brännviddsområdet är inte parallellt med bildens diagonal, vilket tyder på att skannings- och aktiveringshastigheterna inte är kompatibla. ETL skannar (E) snabbare eller (F) långsammare än svepningen av aktiva pixlar i sCMOS. Skalstapel: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Felsökning av ASLM. (A) Ljusarket placeras exakt på brännvidden för detektionlinsen. ETL skannar ljusets fokus längs utbredningsriktningen samtidigt som den synkroniseras med den aktiverade pixeln i sCMOS-sensorn. (B) XY view av fluorescerande pärlor när ETL är korrekt inriktad och synkroniserad. (C-D) Resultat av fluorescerande pärlor på fokalplanet och oskarpa i tvärsnittsbilder, vilket indikerar feljustering mellan ETL-skanning och laserutbredning. Skalstreck: 200 μm och 10 μm i infällningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Ljusarksavbildning av mushjärtan. (A) Volymrenderad bild av multiview deconvolution P1-mushjärta som belyser trabekulationen i ventrikelhålan. (B) Tvärsnittsbilder av det 8 veckor gamla mushjärtat genererade av konventionell LSM (vänster) och ASLM (höger). Bilder presenteras som rådata. (C) Kombination av bildsammanfogning och ASLM för avbildning av ett 8 veckor gammalt mushjärta, bestående av 12 plattor arrangerade i 3 rutor horisontellt och 4 plattor vertikalt. Skalstång: 500 μm. Förkortningar: LV: vänster kammare, LA: vänster förmak, RV: höger kammare och RA: höger förmak. Denna siffra har modifierats från Ref16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Procedur | Tid (P1-mushjärta) | Tid (8 veckor gammalt mushjärta) | Temperatur | |||
| Fix i 4% PFA | Övernattning | Övernattning | 4°C | Beredning av prover | ||
| Tvätta med 1x PBS | 30 minuter | 30 minuter | RT | |||
| Tvätta med 1x PBS | 30 minuter | 30 minuter | RT | |||
| Tvätta med 1x PBS | 30 minuter | 30 minuter | RT | |||
| Bädda in med agarosgel | 1 h | 2 h | RT | |||
| Inkubera i 20 % metanol/80 % DI vatten | 1 h | 2 h | RT | Uttorkning | ||
| Inkubera i 40 % metanol/60 % DI vatten | 1 h | 2 h | RT | |||
| Inkubera i 60 % metanol/40 % DI vatten | 1 h | 2 h | RT | |||
| Inkubera i 80 % metanol/20 % DI vatten | 1 h | 2 h | RT | |||
| Inkubera i 100 % metanol | 1 h | 2 h | RT | |||
| Inkubera i färsk 100 % metanol | 1 h | 2 h | RT | |||
| Inkubera i färsk 100 % metanol | 10 minuter | 10 minuter | 4°C | Pigmentborttagning | ||
| Blekmedel med 5% H2O2 / metanol | Övernattning | Övernattning | 4°C | |||
| Inkubera i 100 % metanol | 1 h | 1 h | RT | |||
| Delipidera med 66 % DCM/33 % metanol i shakern | 3 h | 3 h | RT | Delipidering | ||
| Inkubera i DBE på shakern | 2 dagar | 5 dagar | RT | RI-matchning | ||
Tabell 1: Anpassade vävnadsrensningssteg för autofluorescensavbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framstegen inom avbildning, beräkning och vävnadsrensningsmetoder har gett en oöverträffad möjlighet att i stor utsträckning undersöka hjärtats struktur och funktion. Detta har stor potential för att fördjupa vår förståelse av hjärtats morfogenes och patogenes med hjälp av en intakt hjärtmodell från gnagare. Till skillnad från in vivo-studier av zebrafiskhjärta med ett liknande tillvägagångssätt 40,41,42,43, gör integrationen av avancerade LSM-tekniker och vävnadsrensningsmetoder det möjligt för oss att övervinna utmaningar mellan rumslig upplösning och penetrationsdjup vid avbildning av gnagarmodell 9,44. Vävnadsrensningstekniker gör hjärtan optiskt transparenta genom att avlägsna lipider och andra ljusspridande element, vilket möjliggör djupare bildpenetration45. I kombination med LSM kan vi avbilda myokardiet. Denna kombination förbättrar avbildningsdjupet och gör det möjligt att observera intrikata myokardmikrostrukturer. Även om ett flertal clearingmetoder har etablerats18, har vi anpassat iDISCO20 för att snabbt göra det intakta hjärtat genomskinligt i jämförelse med andra vävnadsrensningsmetoder15, vilket gör det lättillgängligt för avbildning av autofluorescens från myokardium. För specifik fluorescensmärkning kan de ursprungliga iDISCO- och Adipo-Clear46-protokollen kombineras med immunfärgning i detta anpassade avbildningssystem, trots den längre inkubationen. Samtidigt föredras metoder som bevarar endogen fluorescens och kräver kortare bearbetningstid för den föreslagna studien. Till skillnad från andra metoder erbjuder denna plattform följande fördelar. För det första använder vi ett anpassat iDISCO-protokoll för vävnadsrensning, vilket möjliggör snabb rendering av hjärtat transparent på mindre än 1 vecka samtidigt som myokardiets autofluorescens bibehålls. För det andra införlivar vi beräkningsmetoder som bildsammanfogning och multiview-dekonvolution i detta etablerade light-sheet-system för hjärtavbildning. Slutligen designar och synkroniserar vi ASLM-systemet för att förbättra axiell upplösning över en stor FOV, vilket möjliggör avbildning och analys i flera skalor av myokardkomprimering och trabekulering vid en nära isotrop upplösning.
För att fånga hjärtbilder av gnagarmodellen har vi tillhandahållit fyra tillvägagångssätt baserade på LSM: i) den konventionella metoden för screeningändamål19, ii) bildsammanfogning, iii) multiview dekonvolution och iv) ASLM-skanning. Med tanke på variationen i hjärtstorlek mellan olika modeller försökte vi ta itu med den grundläggande kompromissen i spatial upplösning, insamlingshastighet och synfält. Medan bildsammanfogning möjliggör det stora synfältet med kompromissad rumslig upplösning, ger en kombination av det med multiview-dekonvolution eller ASLM nästan isotrop upplösning över det utökade synfältet för att täcka hela det vuxna mushjärtat. Dessutom förbättrar integrationen av dessa metoder bildkvaliteten och kontrasten i den djupa vävnaden, vilket möjliggör en omfattande digital rekonstruktion av 3D-modeller av mikrostrukturer som myokardtrabekulering och komprimering inuti ventriklarna. Översvämningen av datamängder, de omfattande kostnaderna för beräkningsbearbetning, behovet av exakt bildregistrering och potentialen för artefakter i multiview-faltning och bildsammanfogning hindrar dock deras breda tillämpningar. Även om ASLM är ett framväxande alternativ, utgör komplexiteten i systemsynkroniseringen, laserskanningsstrategierna och beroendet av vävnadstransparens utmaningar som kan påverka systemets robusthet och öka risken för fotoskador på hjärtat.
Sammantaget ger denna metodologi, inklusive LSM-avbildning och vävnadsrensning, en utgångspunkt för att utforska hjärtstrukturen från nyfödda till vuxna. Det har potential att lokalisera fördelningen av specialiserade hjärtlinjer och deras funktioner under hjärtats utveckling47. Med utvecklingen av beräkningsanalys skräddarsydd för hjärtapplikationer 6,48,49,50,51,52,53 kan detta ramverk utvidgas för att undersöka hjärtremodelleringsprocesser, särskilt som svar på hjärtinfarkt. I slutändan har denna holistiska strategi potential att avslöja den underliggande mekanismen för hjärtmorfogenes och främja utvecklingen av terapeutiska interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att uppge.
Acknowledgments
Vi uttrycker vår tacksamhet till Dr. Eric Olsons grupp vid UT Southwestern Medical Center för att generöst dela med sig av djurmodellerna. Vi uppskattar alla konstruktiva kommentarer från D-inkubatorns medlemmar på UT Dallas. Detta arbete stöddes av NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) och UT Dallas STARS-programmet (Y.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 - 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
References
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al.
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T.
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
- Preibisch, S., et al.
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
- Sands, G. B., et al. It's clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al.
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).
