Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן
Summary
אנו מתארים פרוטוקול יעיל להפקת "פילה" ההכנות של עוברים תסיסנית של גנוטיפים מסוימים. פרוטוקול זה מאפשר ביצוע יעיל של מגוון רחב של מסכי גנטית. זה גם מאפשר הדמיה מצוינת של מבנים בעובר מאוחר.
Abstract
עוברים תסיסנית בין השלבים 14 ו 17 של ההתפתחות העוברית יכולים להיות גזור ברצון ליצור "פילה" ההכנות. בכל הכנות אלה, את מערכת העצבים המרכזית רץ באמצע, והיא מוקפת קירות הגוף. פנוטיפים שונים רבים נבדקו באמצעות תכשירים אלה. ברוב המקרים, פילה היו שנוצר על ידי דיסקציה של נוגדן מוכתמת כולה הר עוברים קבוע. אלה "והניתוחים קבוע" יש כמה חסרונות, עם זאת. הם זמן רב כדי לבצע, וקשה למיין מוטציה (GFP שלילי) עוברים מן המניות בה מוטציות מתוחזקים על כרומוזומי ה-GFP איזון. מאז 2002, הקבוצה שלנו כבר מנהלת מחסור מסכי ביטוי אקטופי לזהות ligands לרצפטורים יתום. כדי לעשות זאת, פיתחנו פרוטוקולים יעיל לנתיחה העובר לחיות מכתים נוגדן האוספים המכיל מאות קווי מאוזנת. יש לנו למסקנה כי זה הרבה יותר יעיל לבחון פנוטיפים של אוספים גדולים של מניות על ידי לנתיחה לחיות מאשר דיסקציה קבוע. באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, אדם מאומן יחיד יכול המסך עד 10 שורות ליום פנוטיפים, בחינת 4-7 עוברים מוטציה מכל קו תחת מיקרוסקופ המתחם. זה מאפשר זיהוי של מוטציות המקנות עדין, נמוך penetrance פנוטיפים, שכן עד 70 hemisegments בכל שורה הם הבקיע בהגדלה גבוהה עם עדשת מים טבילה 40X.
Protocol
Discussion
אנו מקווים כי זה הפגנה וידאו מוצגת השיטות שלנו לנתיחה העובר מכתים לחיות בפירוט מספיק שהם יכולים כעת להתבצע בקלות על ידי כל אדם שיש לו קצת ניסיון תסיסנית גנטיקה האמבריולוגיה. כמובן, בפועל ניכר עדיין יהיה נדרש, בעיקר עבור והניתוחים עצמם. מניסיוננו, כל אדם לומד את ש?…
Acknowledgements
אנו מודים ניקי פוקס Aloisia שמיד על תרומתם לפיתוח של פרוטוקולים אלה. עבודה זו נתמכה על ידי RO1 NIH להעניק KZ, NS28182.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
