Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Summary

Wir beschreiben eine optimierte Protokoll zur Erzeugung von "Filet" Zubereitungen von Drosophila Embryonen von bestimmten Genotypen. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Durchführung einer Vielzahl von genetischen Screens. Es ermöglicht auch exzellente Visualisierung von Strukturen in den späten Embryo.

Abstract

Drosophila-Embryos zwischen den Stufen 14 und 17 der Embryonalentwicklung kann leicht zerlegt werden, um "Filet" Vorbereitungen zu generieren. In diese Vorbereitungen, läuft das zentrale Nervensystem in der Mitte und wird vom Körper Wänden flankiert. Viele verschiedene Phänotypen untersucht worden mit solchen Präparaten. In den meisten Fällen wurden die Filets von Dissektion der Antikörper-gefärbten festen ganze-mount Embryonen erzeugt. Diese "festen Dissektionen" haben einige Nachteile. Sie sind zeitaufwändig ausführen, und es ist schwierig, Mutante (GFP-negativ) Embryonen aus Beständen, in denen Mutationen auf GFP-Balancer-Chromosomen erhalten bleiben sortieren. Seit 2002 hat unsere Gruppe die Durchführung Mangel und ektopische Expression Bildschirme Liganden für Orphan-Rezeptoren zu identifizieren. Um dies zu tun, haben wir gestrafft Protokolle für die Live-Embryo Dissektion und Antikörper-Färbung von Sammlungen mit Hunderten von symmetrischen Leitungen. Wir haben festgestellt, dass es erheblich effizienter ist, Phänotypen in großen Sammlungen von Vorräten leben Dissektion als durch feste Präparation zu untersuchen. Mit der hier beschriebene Protokoll kann ein einziger trainiert einzelnen Bildschirm bis zu 10 Zeilen pro Tag für Phänotypen, die Prüfung 4-7 mutierten Embryonen aus jeder Zeile unter einem zusammengesetzten Mikroskop. Dies ermöglicht die Identifikation von Mutationen verleihen subtil, low-Penetranz Phänotypen, da bis zu 70 hemisegments pro Zeile bei hoher Vergrößerung mit einem 40x Wasser-Immersions-Objektiv erzielt.

Protocol

Einführung

Drosophila-Embryos zwischen den Stufen 14 und 17 der Embryonalentwicklung kann leicht zerlegt werden, um "Filet" Vorbereitungen zu generieren. In diese Vorbereitungen, läuft das zentrale Nervensystem (ZNS) in der Mitte und wird vom Körper Wänden flankiert. Der Darm wird entfernt. Wenn sie mit Antikörpern gefärbt, damit Filets viel bessere Visualisierung von ZNS und Körper Wandstrukturen (zB Motor Axone, Muskeln, periphere sensorische (PNS) Neuronen, Tracheen) als nicht ganz-mount Embryonen, denn es gibt kein Gewebe, welches zwischen der Vorbereitung und der Deckglas, und weil Filets flach sind, so dass Strukturen, die über den Körper Wand erstrecken sich in einer gemeinsamen Brennebene visualisiert. Viele verschiedene Phänotypen untersucht worden mit solchen Präparaten. In den meisten Fällen sind Filets von Dissektion von Festnetz-, Antikörper-gefärbten ganzen-mount Embryonen erzeugt. Diese festen Präparate werden durch die folgenden Schritte erzeugt:, 2) Fixierung mit Paraformaldehyd / Heptan, 3) Dotterhaut Entfernung mit Methanol, 4) Antikörper-Färbung mittels Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz; 5) Clearing in Glycerin; 1) Chorion Entfernung mit Bleichmittel 6) Dissektion mit Wolfram Nadeln. Detaillierte Protokolle zur Färbung dieser "festen Dissektionen" sind in Lit. zur Verfügung gestellt. [1].

Feste Dissektionen haben einige Nachteile. Erstens ist es oft schwierig, fixiert, gefärbt Mutante (GFP-negativ) Embryonen aus Aktien oder Kreuzen, in denen Mutationen auf GFP-Balancer sind ausgewogen, auch wenn anti-GFP für die Erkennung verwendet zu sortieren. Dies ist auf eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich mütterliche Expression von GFP. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass es fast unmöglich ist, fixiert, gefärbt homozygot mutanten Embryonen aus ausgewogenen dritten Chromosom Aktien entweder mit Aktin-GFP oder Gürteltier (Arm)-GFP-Balancer zu sortieren. Zweitens ist es sehr zeitaufwendig, qualitativ hochwertige feste Dissektionen zu generieren. 10-15 pro Stunde ist etwa so schnell wie die meisten Menschen dies tun können. Drittens haben einige Antikörper nicht gut Fleck in festen Sektionen, entweder weil die Antikörper-Epitope sensitive zu beheben sind, oder weil ein Antikörper, der Flecken internen und externen Strukturen wird durch die äußeren Strukturen "aufgesaugt" und nicht auf interne Strukturen zu durchdringen ( zB Antikörper gegen fasciclin III (FAS3)). Viertens leben Färbung mit Rezeptor-Fusionsproteine ​​zu Ligand Ausdruck erkennen kann nicht fixierten Präparaten durchgeführt werden.

Seit 2002 hat unsere Gruppe die Durchführung Mangel (DF) und ektopische Expression Bildschirme RPTP Liganden zu identifizieren. Um dies zu tun, haben wir gestrafft Protokolle für die Live-Embryo Dissektion und Färbung von Sammlungen mit Hunderten von symmetrischen Leitungen. Färbung für Orphan-Rezeptor-Liganden mit dem Rezeptor-Fusionsproteine ​​ist ein spezialisiertes Programm, das nicht von vielen Gruppen verwendet wird. Allerdings wissen viele Gruppen nutzen Antikörper-Färbung von Filets an embryonalen Phänotypen zu visualisieren. Durch unsere Entwicklung dieser Methoden haben wir festgestellt, dass es erheblich effizienter ist, Phänotypen in großen Sammlungen von Vorräten leben Dissektion als durch feste Präparation zu untersuchen. Wir haben Live-Präparation verwendet werden, um Motor Axon, ZNS, Muskel-Phänotypen in mehr als 600 DFS zu charakterisieren, und haben auch Nervensystems Phänotypen durch ektopische Expression von mehr als 400 verschiedenen Zell-Oberflächen-und sezernierte Proteine ​​(AW et al in Vorbereitung hergestellt wird.; HK. L. et al., in Vorbereitung).

Die Live-Dissektion Protokolle haben wir benutzt haben über die Jahre entwickelt. Einer der Autoren (KZ) wurde zum ersten Mal eingeführt, um die Dissektion mehr als 20 Jahren leben NIPAM Patel, der damals ein Student in der Corey Goodman-Labor. In den letzten Jahren haben wir diese Methode auf das ZNS mit anti-FAS3 [2], sondern beschäftigt festen Sektionen für alle anderen Experimente Fleck. Im Jahr 1999 führte Aloisia Schmid, dann Postdoc in unserer Gruppe, wir Dissektion mit Glas Nadeln, die sie verwendet, um Phänotypen in doppelsträngige RNA-injizierten Embryonen [3, 4] untersuchen zu leben. Wenn wir dabei die RPTP Ligand-Bildschirme ein paar Jahre später begann, haben wir ihr Protokolle geändert werden, um eine schnelle Analyse großer Sammlungen von Aktien über GFP-Balancer aufrechterhalten können. Wir fanden, dass GFP-negative Embryonen leicht von GFP-ausgewogene Bestände sortiert werden, auch wenn es erhebliche mütterliche GFP-Expression (z. B. für die TM3armGFP Balancer), da die Embryonen sortiert sind live und feine Unterschiede in GFP-Expression leicht erkannt werden können. Unsere erfolgreiche Df Bildschirm für eine Lar-Ligand ist in [5] beschrieben.

Mit unserem aktuellen Protokollen kann eine einzige ausgebildete einzelnen Bildschirm 5-10 Zeilen pro Tag für Phänotypen, die Prüfung 4-7 mutierten Embryonen aus jeder Zeile unter einem zusammengesetzten Mikroskop. Nach Auswahl und Anordnen der Embryonen, dauert es etwa 1 Stunde und 50 Embryonen zu sezieren. Diese Methode ermöglicht es uns, Mutationen verleihen subtil, low-Penetration zu identifizierennce Phänotypen sind seit bis zu 70 hemisegments pro Zeile bei hoher Vergrößerung mit einem 40x Wasser-Immersions-Objektiv erzielt. Solche Phänotypen wäre es schwierig oder unmöglich, in Bildschirmen von Kirchenfenstern ganzen-mount Embryonen unter einem Binokular zu erkennen.

Wir haben eine Df-Kit für phänotypische Screening, dass etwa 250 Zeilen enthält und repräsentiert etwa die Hälfte des Genoms (AW et al., In Vorbereitung) definiert. Die Entwicklung dieses Kit wurde als Teil unserer Bildschirm des Bloomington Df Kit begonnen, wie es in den Jahren 2002-2003 gab es für die Gene für RPTP Ligandensynthese [5] erforderlich. Im Zuge dieser Bildschirm, ersetzten wir Bloomington Kit DFS für die Df / Df Homozygoten nicht entwickeln ZNS (und daher nicht für die ZNS-Ligand Ausdruck zu sehen sein) mit kleineren DFS, vorzugsweise molekular zugeordnet, dass eine bessere Entwicklung hatte.

Df / Df Homozygoten von Linien in unserer phänotypische Screening-Kit haben insgesamt ein normales Morphologien auf Stufe 16, so dass ein Ermittler systematisch Bildschirm für die Gene, die Entwicklung des ZNS, PNS, die Muskelfasern, die tracheale Netzwerk und vielen anderen Geweben. Jede Struktur, Expressionsmuster, subzelluläre Lokalisation oder Muster, visualisierbar mit einem spezifischen Antikörper oder GFP-Marker in den Stadien 14-16 kann Phänotypen mit diesem Kit zu sehen sein. Dies bedeutet, dass mit der hier beschriebene Protokoll, könnte eine Person verbringen etwa die Hälfte seiner / ihrer Zeit an diesem Projekt systematisch Bildschirm die Hälfte aller Drosophila-Gene für beliebige embryonalen Phänotyp innerhalb von sechs Monaten bis zu einem Jahr.

A. Drosophila Embryo-Entnahme

1. Prepare "Five-Barrel" Eiersammlung Kammern

Diese Kammern sparen Zeit und Aufwand bei der Prüfung einer großen Anzahl von Fliegenschnüre.

1. Vereinbaren fünf konische 50ml-Reagenzgläser kopfüber an einem unteren Teil eines 100 x 15 mm Kunststoff-Petrischale und kleben Sie die Rohre zusammen mit Silikon-Kautschuk Kleb-und Dichtstoff.
2. Sobald der Kleber ausgehärtet ist, Klebstoff im unteren Teil der Petrischale auf den konischen Enden der Rohre. Fünf konische Röhrchen wird in Stand der Petrischale.
3. Mit einer heißen Nadel, um Löcher in den Rohren für die Luftzirkulation.

2. Bereiten Eiersammlung Platten

1. Gießen Sie etwa 7 ml der Traube Agargel (1%) in jeweils 100 x 15 mm Kunststoff-Petrischale. Die ideale Dicke des Gels ist ca. 3-4 mm zu jedem konischen Rohr abzudichten und Feuchtigkeit für 24 Stunden. Wenn das Gel zu dick ist, kann er herunterfallen, wenn wir die Platte zu ändern.
2. Nach Abkühlung des Gels Platten, Deckel und setzen diese in der ursprünglichen Kunststoff-Petrischale Tasche. Verschließen Sie die Tasche fest und bei 4 ° C lagern

3. Bereiten Sie fliegt

1. Um genügend Eier für die einfache Auswahl von Embryonen der korrekten Stufe zu erhalten, versuchen wir,> 50 Jungfrauen in ein Kreuz auf, zusammen mit> 20 Männer.
2. Wenn ein Kreuz zu sehen sein, mischen die männlichen und weiblichen Fliegen und in eine Fliege Essen Fläschchen mit viel Trockenhefe Pellets auf dem Boden und einem dünnen Papierstreifen (10 X 100 mm, in der Mitte gefaltet) halten gepflanzt in der Mitte des das Essen. Der Papierstreifen wird mehr Fläche und halten die Fliegen vor Feuchtigkeit.
3. Halten Sie das Fläschchen mit Fliegen bei RT für mindestens 3 Tage.
4. Wenn eine Aktie aus einer Flasche zu sehen sein, einfach zu übertragen fliegt in den Sammelraum.

4. Transfer fliegt Fünf-Zylinder Eiersammlung Kammern.

1. Beschriften Sie die jedem Barrel Eiersammlung Kammern.
2. Put Hefepaste auf einem Ei Sammlung Platte für jeden Lauf.
3. Es werden 20 Zentimeter langen Kennzeichnung Band in die Kammer und die Platte zusammen zu halten. Falten 10 mm von jedem Ende für einfache Platte zu ändern.
4. Inject CO _2-Gas in the fly Fläschchen und übertragen Sie die Fliegen in den gekennzeichneten Fässern.
5. Decken Sie die Kammer mit der Eizellenentnahme Platte und nach unten drücken.
6. Band um die Kammer und die Platte zusammen ab der Mitte des Agar-Platte. Das Band wird auf dem Ei Sammlung Platte überlappen.

5. Sammeln Embryonen

1. Bereiten Eiersammlung Platte: Put Hefepaste auf einem Ei Kollekte für jeden Lauf.
2. Tippen Sie die Fliegen in Eiersammlung Kammern und entfernen Sie das Band um die Kammern (Halten Sie den alten Platte fest).
3. Tippen Sie auf der fliegt wieder und ersetzen Sie die alte Platte durch eine neue.
4. Sammeln Embryonen in Schräglage für 2-4 Stunden.
5. Ersetzen Sie die Eiersammlung Platte in der gewünschten Zeit.

6. Alter Embryonen

Legen Sie das Ei Sammlung Platte umgedreht auf einem überdachten Petrischale mit feuchtem 90 mm Kreis Filterpapier und halten bei der gewünschten Temperatur. Für Dissektionen der Stufe 16 Embryonen aus ausgewogenen Mutantenlinien wir in der Regel nicht eine Sammlung in den späten Morgen, dann inkubieren der Embryonen zur> 22 h bei 19 ° C. Für gain-of-function-Studien mit dem UAS/GAL4 System, sammeln wir Embryonen bei RT in den Nachmittag und inkubieren für 16 Stunden bei 19 ° C. Am nächsten Tag übertragen wir die Embryonen in einem 29 ° C Inkubator der UAS/GAL4 für 1 oder 2 Stunden zu aktivieren. Nach dieser Zeit werden die Embryonen meist Stufe 15, und dies ermöglicht genügend Zeit, um Embryonen für die GFP-Expression zu sortieren und ihnen line up, so dass sie auf Stufe 16 sein, wenn die Dissektion durchgeführt wird.

7. Staging Embryonen und Sortierung für die GFP-Expression.

Um zu unterscheiden die Genotypen der Embryonen, verwenden wir GFP-Balancer. Wir untersuchen dechorionated Embryonen auf doppelseitigem Klebeband (siehe nächster Abschnitt) unter einer Olympus GFP Binokular, und wir wählen sie für das Alter und die GFP-Expression zur gleichen Zeit.

a) GFP-Sortierung:

1. Die 2. Chromosom Balancer verwenden wir (CyOarmGFP) hat GFP durch das Gürteltier-Promotor, die während des Ektoderm exprimiert wird angetrieben. CyOarmGFP Heterozygoten sind olivgrün und CyOarmGFP Homozygoten sind leuchtend grün. In einem CyoarmGFP Lager, werden die Embryonen, die Balancer Mangel leicht zu unterscheiden, weil sie fast keine GFP-Expression (sie sehen aus wie Embryonen aus einer Aktie ohne GFP Balancer) haben.
2. Die 3. Chromosom Balancer (TM3armGFP) ist härter für die Sortierung verwenden, weil es mehr mütterlich angetrieben GFP-Expression hat. Als Ergebnis werden die Embryonen in mehr und weniger grün Kategorien unterteilt. Mit etwas Übung ist es meist einfach, die weniger und mehr grün Embryonen aus jeder anderen Art, aber es ist auch notwendig, sie durch die Bündelung von ihnen und Kommissionierung gelegentlich Embryonen, die mehr grün als die anderen sind (TM3armGFP Heterozygoten) nach der Übertragung resort auf der Agarplatte. Ansonsten gibt es sicher einige Embryonen, die von der falschen Genotyp werden.
3. Die X-Balancer ist FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Dies ist in einem Gewebe-spezifische Muster zum Ausdruck gebracht. Die Muster, die für in den Stadien 15-16 Sortierung sind die amnioserosa und zwei Punkte der Meinungsäußerung in den Kopf, was die Bolwig Organ Zellen sind. Leider ist auf der Bühne, wo man will Embryonen zu sortieren, ist die amnioserosa Ausbleichen und die Bolwig Organe noch nicht zu glühen begonnen. Es ist also notwendig, sehr genau anschauen, die Embryonen auf dem Band, oft rollen sie über, um sie für GFP Gäste, und es ist wichtig, um sie auf der Agarplatte Resort. Normalerweise wir dies gleich zweimal: einmal unmittelbar nach dem Umzug alle Embryonen vom Band auf die Platte, und wieder nach der Alterung auf die entsprechende Bühne, kurz bevor sie Futter in Vorbereitung für die Präparation. Manchmal haben wir auch erneut zu prüfen, die Folie unter der GFP Umfang nach der Übertragung der Embryonen in die PBS-Pool (siehe unten), weil Visualisierung von GFP ist besser unter diesen Bedingungen. Dann können wir zerstören Embryonen, die GFP haben kurz vor Beginn der Präparation.

b) Staging

Das wichtigste Werkzeug für die Inszenierung Embryonen in st. 14-16 Darmmorphologie. Der Darm glüht mit Autofluoreszenz unter der GFP Umfang. Vor dem Versuch, Embryonen, sollte man konsultieren Verweis Bücher oder Websites, Bilder und Grafiken von Embryonen haben (zB das Hartenstein und Campos-Ortega grünes Buch), so dass man versteht, was sie aussehen sollten. Die ideale Bühne für die Präparation, wenn der Darm ist in drei Bänder aufgeteilt. Zuvor wird der Darm als einzigen Klumpen. Oft möglichen Embryonen im blob Bühne und dann altert sie, bis sie die beste Bühne für die Präparation zu erreichen. Nach dem Drei-Band-Bühne, beginnt der Darm zu diagonalen Bänder in der Nähe der Schwanz, und dann Spulen zu entwickeln, und der Embryo wird klarer. Innerhalb dieses Zeitraums wird der Embryo schwer zu sezieren, weil es nicht auf den Objektträger haften. Wenn man spät sezieren 16/early Stufe 17 Embryonen will, ist es notwendig, viele Embryonen zu sezieren und zu bewerten, die gut Morphologien mit Embryonen, oder kleben kleben nicht verbunden sind. Diese variiert etwas zwischen Genotypen als auch.

B. Drosophila-Embryo leben Dissektion

1. Embryo dechorionation
   1. Bereiten Sie doppelseitiges Klebeband und Trauben Platte Platte auf einer Folie
   2. Übertragen Sie die im Alter von Embryonen aus der Sammlung Platte auf die doppelseitige Klebeband mit einem nassen Pinsel. Spread-Embryonen gleichmäßig.
   3. Dechorionate die Embryonen auf dem doppelseitigen Klebeband von rollte sie über ihn vorsichtig mit einem stumpfen Präpariernadel. Nach dechorionation werden die Embryonen stärker Stick an das Ende der Nadel als anderen Embryonen oder das Chorion, aber nicht so stark wie das Band, damit eine rollt der Embryonen auf dem Chorion oder auf andere Embryonen, dann hebt es aus und überträgt sie an der Traube Platte Platte. Genotypisierung und Inszenierung (siehe oben für detaillierte Beschreibung) wird während des Prozesses der dechorionation getan undTransfer, um die Nadel.
   4. Nach Zuflucht für Genotyp und Alter bewegen sich die Embryonen zu einem kleineren rechteckigen Platte aus Agar, der breit genug, damit Aneinanderreihung von 10-15 Embryonen in einer Reihe. Richten Sie die dechorionated Embryonen auf dieser Platte: Rückenseite nach unten gegen die Agar Platte und hinteren Enden vor sich hin. Wir machen normalerweise Reihen von 5-10 Embryonen.
2. Bereiten Sie eine Dia-und-Embryonen für die Live-Dissektion
   1. Schneiden Sie ein kleines rechteckiges Stück doppelseitiges Klebeband und legen Sie sie an einem Ende von Super Frost / Plus Objektträger (Fisher Scientific, Kat. Nr. 12-550-15).
   2. Zeichnen Sie ein Rechteck (30-40 mm lang, und die volle Breite der Folie) rund um die Band mit einem Wachs-Stift, so dass es ca. 3 mm Abstand zwischen dem Wachs und Band (Super HT Pap Pen, www.rpicorp. com ) und den Transfer der Embryonen aus der Traube Platte Platte auf das Band, durch Umkehrung der Rutsche und sanft Absenken auf die Embryonen, so dass das Band in Berührung kommt, mit der aufgereihten Embryonen (done unter einem Binokular). Die Embryonen sollten so ausgerichtet, dass das hintere Ende zu Ihnen ist. Sie werden nun dorsal auf der Folie werden.
   3. Sofort im 1X PBS (Gibco Rezept) über die Embryonen, um das Wachs Rechteck zu füllen.
3. Embryo leben Dissektion
   1. Mit einem Glas Dissektion Nadel (aus einer Injektionsnadel), geschnitten entlang der dorsalen Mittellinie, ausgehend von dem hinteren Ende des Embryos.
   2. Poke das vordere Ende des Embryos, Lift-up und Transfer des Embryos, um die Folie bis es klebt. Keep Embryonen in den Puffer. Machen Sie eine geordnete Reihe von Embryonen auf die Folie, die jede Zeile passt auf die Agar-Platte. Organisieren Sie die Zeilen so, dass sie alle auf der Folie passen.
   3. Es gibt eine Vielzahl von möglichen Zerlegung Sequenzen, die bei der Erzeugung Filets verwendet werden können. Die Menschen in der Regel ihre eigenen optimierte Verfahren durch das Tun der Dissektionen sich. Das Video zeigt eine Sequenz, in der ein kleiner Schnitt am hinteren Ende des Embryos durchgeführt wird, um die beiden Seiten des Körpers Wand voneinander getrennt. Wenn gewünscht, kann man auch brechen Mitteldarm / Enddarm Zusammenhang mit diesem Schnitt, und verdrängen den Enddarm aus auf den Objektträger zu diesem Zeitpunkt (in der Video-, Enddarm Verschiebung wird später erfolgen). Dann werden Schnitte auf jeder Seite direkt hinter der Hirnlappen vorgenommen, um den Körper Mauern aus dem Gehirn zu trennen. Je nach Alter des Embryos, kann man auch brauchen, um eine flache abgeholzt der dorsalen Mittellinie zu machen, um die amnioserosal Verbindung zwischen dem Körper Wände zu trennen.
   4. Dann sanft den Klappen der Körperwand auf der Folie einfügen, Vermeidung streckte sie oder Abtragen von Material von der Oberfläche. Dies geschieht am besten, indem nur die Nadel auf den vorderen und hinteren Ecken an der dorsalen Kanten des Körpers Wandkontakt getan. Der Motor Axone nicht verlängern so weit dorsal, so im besten Fall wird dies ein Embryo mit vollkommen intakt ISN Niederlassungen produzieren. In einigen Fällen ist die ISN abgeschnitten werden, selbst mit der besten Technik, weil der Embryo nicht immer genau trennen entlang der dorsalen Mittellinie. Wenn es richtig gemacht, wird diese Methode den Körper Wandstrukturen in Segmente T3-A6 (ungefähr) zu bewahren.
   5. Man kann den Mitteldarm auf der Oberseite des Embryos zu verlassen, und entfernen Sie sie dann aus allen seziert Embryonen nach Abschluss aller Sektionen. Dies wird durch Stossen im Darm, verdrängen sie weg aus dem Embryo, und Stretching es seine Verbindung mit dem Vorderdarm, die unter dem Hirnlappen liegt brechen. Oder kann man das gut aus jeder Sektion zu entfernen, wie man es beendet. Mit Mutanten, die abnormal gut die Entwicklung haben, ist es ein Vorteil für alle den Mut auf einmal zu entfernen nach Beendigung der Sektionen, weil freigegeben Eigelb aus dem Darm kann es schwieriger machen, um später transferierten Embryos auf die Folie kleben nach der Übertragung aus dem doublestick Band . Manchmal ist es hilfreich zu übertragen die Embryonen ab dem unteren Rand der Folie (hin) anstatt an der Spitze, wie Eigelb dazu neigt, zu Ihnen auf die typischen Bewegungen der Nadel zu verbreiten.
4. Fixierung und Immunfluoreszenz / Immunhistochemie
   1. An dieser Stelle kann man entweder fix die Embryonen sofort, wenn man mit Antikörpern ist Färbung, oder man kann die PBS zu entfernen und ersetzen sie durch Fusionsprotein Überstand, wenn man tut, ist ein Live-Färbung Experiment Ligand Ausdruck zu erkennen. Dieser Aspekt des Experiments ist im Detail in den Methoden-und Ergänzungsmethoden Abschnitte ref beschrieben. [5].
   2. Hier beschreiben wir die Fixierung-Protokoll, das entweder sofort oder nach Fusionsprotein Färbung geschieht. Mit zwei Pasteurpipetten, ersetzen Sie das PBS mit 5% Paraformaldehyd in PBS (EMS, Cat. # 15713-S, www.emsdiasum.com). Exchange in fix Lösung dreimal, die mit ca. 6 ml fix Lösung, da eine Pasteurpipette hält beinhaltet1,5-2 ml Lösung. Fix für 45 '.
   3. Entfernen Sie fix Lösung mit PBS (3 Änderungen) zu ersetzen, dann mit PBT (PBS + 0,1% Triton X-100 + 1 mg / ml BSA Fraktion V, 3 Änderungen), dann ersetzen PBT mit ~ 200 ul Block-Lösung (PBT + 5 % wärmebehandelt normalem Ziegenserum), dann mit dem gewünschten primären Antikörper in Block-Lösung. Es ist sehr wichtig, nicht zulassen, dass der Meniskus, die Embryonen Kontakt, vor allem während sie in PBS werden, da dies die Sektionen zerstören wird. Nach Waschmittel fügte der Embryonen unempfindlicher gegen den Meniskus. So kann man das PBT mit Block ersetzen durch Kippen der Rutsche und Löschpapier aus den meisten der Lösung durch das Berühren eines Kimwipe kurz auf die Ecke des Bereichs durch das Wachs eingeschlossen. Die gleiche Methode kann verwendet werden, um den Block mit anti Körper Lösung zu ersetzen. Dies minimiert Verschleppung von Lösungen.
   4. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C, dann waschen mit PBT (> 15 Minuten / Waschgang) 3X in einer Schale auf einem Schaukelstuhl Plattform (stellen Sie sicher, es gibt genug PBT, so dass der Schlitten immer vollständig beim Wippen eingetaucht), reblock wie oben beschrieben, mit 200 ul sekundären Antikörper, Inkubation 2 Stunden. bei RT, Nachwaschen mit PBT. Überprüfen Färbung (wenn grüne Fluoreszenz verwendet wird), wenn unter der GFP Binokular gewünscht.
   5. Wash 2X mit PBS (5 '), dann fügen Sie 500 ul 70% glycerol/1X PBS (hergestellt durch Mischen 35 ml Glycerin, 5 ml 10X PBS und 10 ml Wasser in einen 50 ml Tube), und deutlich über Nacht bei 4 ° C (oder für 2 h bei RT). Entfernen Glycerin und auf eine Nr. 1 Deckglas.

Discussion

Wir hoffen, dass dieses Video-Demonstration hat unsere Methoden für Live-Embryo Dissektion und Färbung ausreichend detailliert, dass sie nun leicht durch eine Person, die eine gewisse Erfahrung in Drosophila-Genetik und Embryologie hat ausgeführt werden angezeigt. Natürlich wird erhebliche Praxis noch erforderlich, vor allem für die Sektionen selbst zu sein. Nach unserer Erfahrung wird jede Person, die die Live-Dissektion Methoden lernt schaffen eine differenzierte Dissektion Protokoll, dass ihm / ihr die meisten schnell in hoher Qualität gekleidet Dissektionen können. Dieser Prozess erfordert Monate für volle Entfaltung. Allerdings können die meisten Menschen hochwertige Dissektionen nach ein paar Wochen von der Praxis zu generieren.

Obwohl wir die Verwendung von Live-Sektionen für das Screening begünstigen, können sie nicht ersetzen feste Dissektionen, da feste Dissektion Protokolle zu einer breiteren Palette von embryonalen Stadien angewendet werden können. Zum Beispiel in der Analyse unserer Df-Kit für den Motor Axon Führung Phänotypen, fanden wir, dass die Details des Motors Axon Niederlassungen, darunter Filopodien, kann viel besser visualisiert Immunfluoreszenzfärbung von Live-Filets als durch herkömmliche Meerrettichperoxidase (HRP) immunhistochemische Visualisierung von festen Filets (Beispiele für qualitativ hochwertige HRP-Färbung, siehe die Grundierung des Motors Axon Leitlinien für unser Labor Web-Seite). Allerdings wird Embryonen älter als der Beginn der Stufe 17 nicht auf SuperFrost Plus-Stick gleitet aufgrund ihrer Entwicklung Nagelhaut. So für die quantitative Analyse von Phänotypen für die späte Entwicklung der motorischen Axon Branchen wie der SNa wir immer noch auf festen Dissektionen (AW et al., In Vorbereitung).

Derzeit sind diese Methoden nur ein paar Probleme mit unserer Gruppe angewandt. Dazu gehören die Identifizierung und phänotypische Analyse neuer Gene im ZNS und Motor Axon Führung, die Identifizierung von Orphan-Rezeptor-Liganden beteiligt, und die Identifizierung von Genen für die Synthese von Epitopen durch spezifische mAk erkannt erforderlich. Allerdings können viele andere Anwendungen vorgestellt werden, insbesondere wenn diese Methoden mit der Analyse unserer Df-Kit und ektopische Expression Kollektion kombiniert werden, oder von Sammlungen von anderen Forschern erzeugt. Zum Beispiel sollte es möglich sein, systematisch Bildschirm für die Gene für die Synthese, zelluläre Expressionsmuster oder subzelluläre Lokalisierung von Proteinen, die durch eine hochwertige Antikörper oder ein GFP-Reporter detektiert werden können erforderlich.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9