La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos
Summary
Se describe un protocolo eficiente para la generación de "filete" los preparativos de los embriones de Drosophila de genotipos específicos. Este protocolo permite la ejecución eficiente de una variedad de exámenes genéticos. También permite una excelente visualización de las estructuras en el embrión tarde.
Abstract
Embriones de Drosophila entre las etapas 14 y 17 del desarrollo embrionario puede ser fácilmente disecado para generar "filete" los preparativos. En estos preparativos, el sistema nervioso central baja por la mitad, y está flanqueado por las paredes del cuerpo. Muchos diferentes fenotipos han sido examinadas con estos preparados. En la mayoría de los casos, los filetes se han generado por la disección de anticuerpo teñido de montaje fijo de todo el embrión. Estos "disecciones fijos" tienen algunas desventajas, sin embargo. Ellos llevan mucho tiempo en ejecutarse, y es difícil de clasificar mutante (GFP-negativos), los embriones de las existencias en los que las mutaciones se mantienen en el equilibrio de los cromosomas GFP. Desde 2002, nuestro grupo ha llevado a cabo la deficiencia y las pantallas ectópico expresión para identificar ligandos para los receptores huérfanos. Con el fin de hacer esto, hemos desarrollado protocolos simplificados para la disección de embriones vivos y la tinción de anticuerpos de las colecciones que contienen cientos de líneas equilibradas. Hemos concluido que es mucho más eficiente para examinar los fenotipos de las grandes colecciones de las reservas mediante la disección en vivo de la disección fijo. Utilizando el protocolo descrito aquí, una persona capacitada solo pueden detectar hasta 10 líneas por cada día de fenotipos, el examen de 4-7 embriones mutantes de cada línea con un microscopio compuesto. Esto permite la identificación de mutaciones que confieren sutil, de baja penetrancia fenotipos, ya que el 70 hemisegments por línea se anotan al gran aumento de 40X con una lente de inmersión en agua.
Protocol
Discussion
Esperamos que este video de demostración ha mostrado nuestros métodos de disección de embriones vivos y la tinción con el suficiente detalle que ahora pueden ser fácilmente ejecutadas por cualquier persona que tenga alguna experiencia en Drosophila genética y la embriología. Por supuesto, mucha práctica seguirá siendo necesaria, sobre todo para las propias disecciones. En nuestra experiencia, cada persona que aprende los métodos de disección en vivo va a crear un protocolo de disección sutilmente di…
Acknowledgements
Damos las gracias a Nicki Fox y Schmid Aloisia por sus contribuciones al desarrollo de estos protocolos. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH RO1 a KZ, NS28182.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
