のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法
Summary
我々は、特定の遺伝子型のショウジョウバエの胚の"フィレット"の準備を生成するための合理化プロトコルを記述する。このプロトコルは、遺伝子スクリーニングの様々な効率的な実行が可能になります。また、後期胚における構造物の優れた視覚化することができます。
Abstract
胚発生の段階で14と17との間のショウジョウバエの胚は、容易に"フィレット"の準備を生成するために解剖することができます。これらの製剤では、中枢神経系では、真ん中の下に実行され、ボディの壁に挟まれている。多くの異なる表現型は、このような調製物を用いて検討されています。ほとんどの場合、切り身は、抗体染色の固定ホールマウント胚の解剖によって生成されました。これらの"固定された解剖では、"しかし、いくつかの欠点を持っている。彼らは、実行には手間がかかる上に、それは突然変異がGFPのバランサー染色体にわたって維持されている銘柄から変異体（GFP陰性）胚をソートすることは困難です。 2002年以来、私たちのグループは、オーファン受容体に対するリガンドを同定するために欠乏し、異所性発現の画面に行ってきました。これを行うために、我々は生きている胎児の解剖とバランスのとれた、数百行を含むコレクションの抗体染色のための合理化されたプロトコルを開発した。我々はそれが固定された解剖ではなく、ライブ解剖による株式の大規模なコレクションの表現型を調べるためにかなり効率的であると結論付けている。ここで記述されたプロトコルを使用して、単一の訓練を受けた個人が化合物の顕微鏡下でそれぞれのラインから4月7日変異体胚を調べて、表現型の1日あたり10行まで選別できます。これは微妙な、低浸透表現型を付与する変異の同定を可能にする、行あたり最大70 hemisegments以降は40X水浸レンズと高倍率で採点されます。
Protocol
Discussion
我々は、このビデオのデモは、それらが今容易にショウジョウバエの遺伝学と発生学のいくつかの経験を有する者により実行可能であることを十分に詳細で生きている胎児の解剖や染色のために我々の方法を表示していることを願っています。もちろん、かなりの練習が依然として主に解剖自身のために、必要となります。我々の経験では、ライブ解剖の方法を学ぶすべての人は彼/彼…
Acknowledgements
我々はこれらのプロトコルの開発への貢献のためにニッキーフォックスとAloisiaシュミットに感謝。この作品は、KZ、NS28182にNIH RO1の助成金によって支えられている。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
