VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri
Summary
Biz belirli genotipler Drosophila embriyolar "fileto" hazırlıkları üretmek için akıcı bir protokol açıklar. Bu protokol, genetik ekranlardan çeşitli verimli bir şekilde yürütülmesini sağlar. Aynı zamanda geç embriyo yapıları mükemmel görselleştirme sağlar.
Abstract
Embriyonik gelişim aşamaları 14 ve 17 arasında Drosophila embriyolar "fileto" hazırlıkları kolayca oluşturmak için disseke edilebilir. Bu hazırlıkların, merkezi sinir sisteminin ortasında aşağı doğru akıyor ve beden duvarları ile çevrili. Birçok farklı fenotipleri Bu hazırlıkların kullanılarak incelenmiştir. Çoğu durumda, fileto antikor lekeli sabit tüm monte embriyoların diseksiyon tarafından üretildi. Bu "sabit diseksiyonları" Ancak, bazı dezavantajları var. Onlar çalıştırmak için zaman alıcı ve mutant (GFP-negatif) mutasyonlar GFP dengeleyici kromozom üzerinde tutulur stokları embriyolar sıralamak için zordur. 2002 yılından bu yana, bizim grup yetim reseptörlerine ligandlar tanımlamak için eksikliği ve ektopik ifade ekranlar yürütülmesi olmuştur. Bunu yapmak için, canlı embriyo diseksiyon ve dengeli hatları yüzlerce içeren koleksiyonlar antikor boyama aerodinamik protokolleri geliştirmiştir. Biz sabit diseksiyon ile daha canlı diseksiyon stoklarının büyük koleksiyonlarda fenotipleri incelemek için çok daha verimli olduğu sonucuna varmışlardır. Burada açıklanan protokol kullanarak, tek bir bileşik mikroskop altında inceleyerek her satırın 4-7 mutant embriyolar fenotipleri için gün başına 10 satır, eğitimli birey ekranı. Bu satır başına kadar 70 hemisegments 40X su daldırma lens ile yüksek büyütmede gol beri mutasyonlar, ince, düşük penetrans fenotipleri görüşmekte belirlenmesini sağlar.
Protocol
Discussion
Biz bu video gösteri artık kolayca Drosophila genetik ve embriyoloji bazı deneyimi olan herhangi bir kişi tarafından idam edilebilir canlı embriyo diseksiyon ve yeterli ayrıntıda boyama yöntemleri görüntülenir olduğunu umuyoruz. Tabii ki, öncelikle diseksiyonları kendileri için önemli bir uygulama hala gerekli olacaktır. Bizim tecrübelerimize göre, her canlı diseksiyon yöntemleri öğrenir kişi onu / onu en hızlı, yüksek kaliteli dizilmiş diseksiyonları üretmek için izin veren bir …
Acknowledgements
Biz Nicki Fox ve Aloisia Schmid, bu protokollerin gelişmesine yaptıkları katkılar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, KZ, NS28182 bir NIH RO1 hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
