के लाइव विच्छेदन ड्रोसोफिला भ्रूण एंटीबॉडी धुंधला द्वारा उत्परिवर्ती संग्रह स्क्रीनिंग के लिए सुव्यवस्थित तरीके
Summary
हम विशिष्ट जीनोटाइप का ड्रोसोफिला भ्रूण की "पट्टिका" तैयारी पैदा करने के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक स्क्रीन की एक किस्म के कुशल निष्पादन की अनुमति देता है. यह भी देर से भ्रूण में संरचनाओं के उत्कृष्ट दृश्य की अनुमति देता है.
Abstract
ड्रोसोफिला भ्रूण भ्रूण विकास के 14 और 17 चरणों के बीच आसानी से हो "पट्टिका" तैयारी उत्पन्न विच्छेदित कर सकते हैं . इन तैयारियों में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के बीच नीचे चलाता है, और शरीर की दीवारों द्वारा flanked है. कई अलग अलग phenotypes ऐसी तैयारी का उपयोग कर जांच की गई है. ज्यादातर मामलों में, fillets एंटीबॉडी से सना हुआ तय पूरे माउंट भ्रूण के विच्छेदन के द्वारा उत्पन्न किया गया. "ये तय dissections" कुछ नुकसान है, लेकिन. वे निष्पादित करने के लिए समय लेने हैं, और यह मुश्किल है के शेयरों में जो परिवर्तन GFP balancer के गुणसूत्रों से अधिक रखा जाता है से उत्परिवर्ती भ्रूण (GFP नकारात्मक) सॉर्ट है. 2002 के बाद से, हमारे समूह की कमी और अस्थानिक अभिव्यक्ति स्क्रीन आयोजन किया गया है अनाथ रिसेप्टर्स के लिए ligands की पहचान. आदेश में यह करने के लिए, हम रहते भ्रूण विच्छेदन और संतुलित लाइनों के सैकड़ों युक्त संग्रह के एंटीबॉडी धुंधला के लिए सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल विकसित किया है. हम यह निष्कर्ष निकाला है कि यह काफी अधिक कुशल है तय विच्छेदन के द्वारा की तुलना में रहते विच्छेदन के द्वारा शेयरों के बड़े संग्रह में phenotypes की जांच. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित का प्रयोग, एक एकल प्रशिक्षित व्यक्ति phenotypes के लिए प्रति दिन 10 लाइनों, प्रत्येक पंक्ति से एक यौगिक खुर्दबीन के तहत 4-7 उत्परिवर्ती भ्रूण की जांच करने के लिए स्क्रीन कर सकते हैं. यह सूक्ष्म, कम penetrance phenotypes प्रदान म्यूटेशनों, के बाद से प्रति पंक्ति 70 hemisegments उच्च वृद्धि पर एक 40x लेंस पानी विसर्जन के साथ रन बनाए हैं की पहचान की अनुमति देता है.
Protocol
Discussion
हमें उम्मीद है कि इस वीडियो प्रदर्शन रहते भ्रूण विच्छेदन और पर्याप्त विस्तार में धुंधला हो जाना है कि वे अब आसानी से कर सकते हैं किसी भी व्यक्ति जो ड्रोसोफिला आनुवंशिकी और भ्रूणविज्ञान में कुछ अनु…
Acknowledgements
हम इन प्रोटोकॉल के विकास के लिए उनके योगदान के लिए Nicki फॉक्स और Aloisia स्च्मिद धन्यवाद. KZ, NS28182 के लिए यह काम एक NIH RO1 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
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