De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling
Summary
Deze video protocol illustreert de squash techniek die gebruikt wordt in de Johansen laboratorium voor te bereiden<em> Drosophila</em> Polytheen chromosomen voor antilichaam labeling.
Abstract
Drosophila is al lang een favoriet modelsysteem voor het bestuderen van de relatie tussen de structuur van chromatine en genregulatie als gevolg van de cytologische voordelen die door de reus speekselklieren polytheen chromosomen van de derde instar larven. In dit weefsel worden de chromosomen ondergaan vele ronden van replicatie in de afwezigheid van celdeling die aanleiding geven tot ongeveer 1000 exemplaren. Het DNA blijft uitgelijnd na elke replicatieve cyclus resulteert in sterk vergroot chromosomen die een unieke kans om chromatine morfologie correleren met de lokalisatie van specifieke eiwitten te verstrekken. Bijgevolg is er een hoge mate van interesse in het definiëren van de epigenetische modificaties aanwezig op verschillende genen en in verschillende stadia van het transcriptie proces. Een belangrijk instrument voor een dergelijk onderzoek is de etikettering van polytheen chromosomen met antistoffen tegen het enzym, transcriptie factor, of histon-eiwitten van belang. Deze video protocol illustreert de squash techniek die gebruikt wordt in de Johansen laboratorium om Drosophila polytheen chromosomen voor te bereiden voor antilichaam labeling.
Protocol
Discussion
De opname van azijnzuur en melkzuur in de conventionele squash fixatie-protocollen faciliteert zowel interband resolutie en chromosomale arm verspreiden, maar helaas sommige epitopen niet overleven deze behandeling. Een voorbeeld van een dergelijke epitoop is H3S10ph (Cai et al.., 2008). Omdat behandeling met zuur heeft ook het nadeel dat het de inherente fluorescentie van GFP-gemerkte eiwitten, Dimario et al. lest. (2006) recent ontwikkelde een formaldehyde-based "zuurvrij squash techniek" d…
Acknowledgements
Wij danken mevrouw V. Lephart voor het onderhoud van de vlieg voorraden Dit werk werd ondersteund door National Institutes for Health-subsidie (GM62916) en de National Science Foundation subsidie (MCB0817107).
References
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).
- Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods. 48, 387-397 (2009).
