Préparation des Courges drosophile chromosomes polytènes pour marquage de l'anticorps
Summary
Ce protocole vidéo illustre la technique de squash utilisés dans le laboratoire de Johansen pour préparer<em> Drosophile</em> Chromosomes polytènes pour l'étiquetage des anticorps.
Abstract
Drosophile a longtemps été un modèle de système de prédilection pour étudier la relation entre la structure de la chromatine et la régulation des gènes en raison des avantages cytologique fournie par le géant de chromosomes polytènes salivaires des glandes du stade larvaire tiers. Dans ce tissu les chromosomes subissent de nombreux cycles de réplication, en l'absence de la division cellulaire donnant naissance à environ 1000 exemplaires. L'ADN reste alignée après chaque cycle réplicatif résultant dans des chromosomes fortement agrandie qui fournissent une occasion unique de mettre en corrélation la morphologie chromatine avec la localisation des protéines spécifiques. En conséquence, il a été un haut niveau d'intérêt dans la définition des modifications épigénétiques présents à des gènes différents et à différentes étapes du processus de transcription. Un outil important pour de telles études est l'étiquetage des chromosomes polytènes avec des anticorps à l'enzyme, facteur de transcription, ou la modification des histones d'intérêt. Ce protocole vidéo illustre la technique de squash utilisés dans le laboratoire de Johansen pour préparer la drosophile chromosomes polytènes pour l'étiquetage des anticorps.
Protocol
Discussion
L'inclusion d'acides acétique et lactique dans les protocoles conventionnels de fixation facilite la résolution de squash et deux interbandes bras chromosomique propagation mais malheureusement, certains épitopes ne survivent pas à ce traitement. Un exemple d'un tel épitope est H3S10ph (Cai et al., 2008). Depuis traitement à l'acide a aussi l'inconvénient qu'il désaltère la fluorescence intrinsèque des protéines étiquetées GFP, DiMario et al. (2006) a récemment dé…
Acknowledgements
Nous remercions Mme V. Lephart pour l'entretien des stocks de volée Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé de subvention (GM62916) et la National Science Foundation subvention (MCB0817107).
References
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).
- Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods. 48, 387-397 (2009).
