Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l'etichettatura di anticorpi
Summary
Questo protocollo video illustra la tecnica di zucca utilizzata in laboratorio per preparare Johansen<em> Drosophila</em> Cromosomi politenici per l'etichettatura degli anticorpi.
Abstract
Drosophila è stata a lungo un sistema di preferiti modello per studiare la relazione tra struttura della cromatina e regolazione dei geni per i vantaggi citologico fornite dal cromosomi giganti ghiandola salivare polytene larve del terzo stadio. In questo tessuto i cromosomi subiscono molti cicli di replicazione in assenza di divisione cellulare dando luogo a circa 1000 copie. Il DNA rimane allineata dopo ogni ciclo replicativo conseguente cromosomi notevolmente allargata che forniscono una opportunità unica per correlare morfologia della cromatina con la localizzazione di specifiche proteine. Di conseguenza, c'è stato un elevato livello di interesse nella definizione delle modificazioni epigenetiche presenti in geni diversi e in diverse fasi del processo di trascrizione. Un importante strumento per tali studi è l'etichettatura dei cromosomi politenici con anticorpi per l'enzima, fattore di trascrizione o la modifica degli istoni di interesse. Questo protocollo video illustra la tecnica di zucca utilizzata in laboratorio per preparare Johansen Drosophila cromosomi politenici per l'etichettatura degli anticorpi.
Protocol
Discussion
L'inclusione degli acidi acetico e lattico in protocolli convenzionali fissazione da squash facilita sia la risoluzione interbanda e braccio cromosomico diffusione ma purtroppo alcuni epitopi non sopravvivono a questo trattamento. Un esempio di tale epitopo è H3S10ph (Cai et al., 2008). Poiché il trattamento acido ha anche lo svantaggio che disseta la fluorescenza intrinseca di proteine GFP-tagged, DiMario et al. (2006) ha recentemente sviluppato una base di formaldeide "acid-free tecn…
Acknowledgements
Ringraziamo la signora V. Lephart di mantenimento delle scorte volare Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes for Health di sovvenzione (GM62916) e la National Science Foundation di sovvenzione (MCB0817107).
References
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).
- Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods. 48, 387-397 (2009).
