生細胞で蛍光タンパク質とのデュアルプローブ光の強調表示を精製の光変換
Summary
このプロトコルは、共焦点レーザー走査型顕微鏡に蛍光タンパク質の光変換を実行するための一般的なアプローチを説明します。我々はpuriedタンパク質試料の光変換用だけでなく、mOrange2とドロンパと、生細胞におけるデュアルプローブ光学ハイライトするための手順を説明します。
Abstract
Photoconvertible蛍光タンパク質は、（PC – FPS）蛍光の色が特定の波長の光への曝露によって変更することができることを意味する、"光学式ハイライト"機能を持つ蛍光タンパク質のクラスです。光の強調表示は、非侵襲的蛍光分子の集団をマークすることを許可されているので、単一の細胞または細胞小器官を追跡するのに最適です。
効率的な光変換のための重要なパラメータは、光電変換光の強度と露光時間です。強度が低すぎる場合、光変換は全く発生が遅いかどうかになります。一方、多すぎる強度や長すぎる露出は、タンパク質の光退色し、それによって光変換の効率を減らすことができます。
このプロトコルは、どのようにPC – FPの光電変換アプリケーションのための共焦点レーザー走査型顕微鏡を設定する一般的なアプローチを説明します。まず、精製されたタンパク質の液滴の試料を調製するための手順を説明します。このサンプルフォーマットには、顕微鏡下で蛍光タンパク質の光物理的挙動を研究するために非常に便利です。第二に、我々は、光変換用の顕微鏡を構成する方法を示すために蛋白質の液滴のサンプルを使用します。そして最後に、我々はmOrange2とドロンパとのデュアルプローブ光学ハイライトを含む生きている細胞の光学強調表示、実行する方法を説明します。
Protocol
Discussion
精製した蛍光タンパク質の液滴のサンプルでは、光退色反応速度論と光電変換反応速度を研究するために、例えば、蛍光タンパク質の光物理的特性評価のための非常に便利なサンプルフォーマットです。非常に小さな液滴の体積（〜20ピコリットル）のキュベットベースのシステムで実行することが困難な場合も退色や光変換の実験を、容易に。ここに示されているように加えて、液滴?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNAを提供するためのマイクW.ダビッドソン（フロリダ州立大学）を感謝。この作品は、厚生助成金GM72048（DWPへ）の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
