라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion
Summary
이 프로토콜은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 형광 단백질 photoconversion을 수행하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 우리는 puried 단백질 샘플 photoconversion뿐만 아니라 mOrange2과 Dronpa 살 세포의 듀얼 프로브 광학 하이라이트를위한 절차를 설명합니다.
Abstract
Photoconvertible 형광 단백질 (PC – 프레임)는 형광의 색깔이 특정 파장의 빛에 노출에 의해 변경될 수있다는 것을 의미한다 "광학 형광펜"기능이있는 형광 단백질의 클래스입니다. 광학 강조는 비침 투 형광 분자의 subpopulation의 마킹 수 있으며, 따라서 하나의 셀 또는 organelles를 추적하기위한 이상적입니다.
효율적인 photoconversion에 대한 중요 매개 변수는 강도와 photoconversion의 빛의 노출 시간입니다. 강도가 너무 낮으면 photoconversion 전혀 발생 느리거나되지 않습니다. 반면에, 너무 강렬하거나 너무 오래 노출이 단백질을 photobleach시키고 photoconversion의 효율성을 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜은 방법 PC – FP의 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 설정하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 첫째, 우리는 정제된 단백질 비말 샘플 준비를위한 절차를 설명합니다. 이 예제 형식은 현미경으로 형광 단백질의 photophysical 동작을 공부 매우 편리합니다. 둘째, 우리는 photoconversion에 대한 현미경을 구성하는 방법을 보여 단백질 비말 샘플을 사용합니다. 그리고 마지막으로, 우리는 mOrange2과 Dronpa와 함께 듀얼 프로브 광 하이라이트를 포함하여 살고 세포에 광학 하이라이트를 수행하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Discussion
정화 형광 단백질 비말 샘플 속도론 및 photoconversion의 속도론을 photobleaching 공부 예를 들어, 형광 단백질의 특성에 대한 photophysical 매우 편리한 샘플 형식입니다. 매우 작은 비말 볼륨 (~ 20 picoliter) photobleaching과 쿠베트 기반 시스템에서 수행하기 어려울 수 있습니다 photoconversion 실험, 용이하게합니다. 또한, 같은 비말 샘플이 이상적으로 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 현미경을 설정하는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 형광 단백질을 인코딩 플라스미드 DNA를 제공하는 마이크 W. 데이비슨 (플로리다 주립 대학)을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 건강 부여 GM72048 (전자 파동 탐색)을 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
