Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר גישה כללית לבצע photoconversion של חלבוני ניאון על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. אנו מתארים נהלים photoconversion של דגימות חלבון puried, כמו גם עבור dual-בדיקה אופטי הדגשת בתאים חיים עם mOrange2 ו Dronpa.
Abstract
חלבוני ניאון Photoconvertible (pc-FPS) הם קבוצה של חלבוני ניאון עם יכולת "סימון אופטי", כלומר, את צבע פלואורסצנטי ניתן לשנות על ידי חשיפה לאור באורך גל מסוים. הדגשת אופטית לא פולשנית מאפשרת סימון של subpopulation של מולקולות ניאון, ולכן הוא אידיאלי עבור מעקב אחר תאים בודדים או אברונים.
פרמטרים קריטיים עבור photoconversion יעיל הן בעוצמה את זמן החשיפה של האור photoconversion. אם העוצמה נמוכה מדי, photoconversion יהיה איטי או לא להופיע בכלל. מצד שני, בעוצמה רבה מדי או חשיפה ארוכה מדי יכולה photobleach החלבון ובכך להפחית את היעילות של photoconversion.
פרוטוקול זה מתאר גישה כללית כיצד להגדיר מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה עבור PC-FP יישומים photoconversion. ראשית, אנו מתארים תהליך להכנת מטוהרים אגל דגימות חלבון. מתכונת זו מדגם מאוד נוח לחקר התנהגות photophysical של חלבוני ניאון מתחת למיקרוסקופ. שנית, אנו נשתמש מדגם טיפה חלבון כדי להראות כיצד להגדיר את המיקרוסקופ עבור photoconversion. ולבסוף, אנו נראה כיצד לבצע סימון אופטי בתאים חיים, כולל כפול בדיקה אופטי עם הדגשת mOrange2 ו Dronpa.
Protocol
Discussion
המדגם מטוהרים פלורסנט אגל חלבון הוא פורמט דגימה מאוד נוח אפיון photophysical של חלבוני ניאון, למשל ללמוד photobleaching קינטיקה קינטיקה photoconversion. נפח טיפה קטנה מאוד (~ 20 picoliter) מקלה photobleaching וניסויים photoconversion, אשר יכול להיות קשה לבצע במערכות קובט מבוסס. בנוסף, כפי שמוצג כאן המדגם אגל ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מייק W. דוידסון (פלורידה סטייט) למתן DNA פלסמיד קידוד חלבוני ניאון. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM72048 (עד בעירייה).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
