Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim
Summary
Bu protokol bir konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri Fotoçevrim gerçekleştirmek için genel bir yaklaşım açıklar. Biz Fotoçevrim puried protein örneklerinin yanı sıra, mOrange2 ve Dronpa canlı hücreleri çift prob, optik vurgulama için prosedürler açıklanmaktadır.
Abstract
Photoconvertible floresan proteinleri (pc-FP) floresan renk, belirli bir dalga boyunda ışığa maruz tarafından değiştirilebilir anlamına gelir "optik işaretleme" özelliğine sahip bir sınıf, floresan proteinleri. Optik vurgulayarak, noninvaziv bir ICSI'nin floresan moleküllerin işaretlenmesi sağlar ve bu nedenle tek hücreler veya organeller izlemek için idealdir.
Verimli Fotoçevrim için kritik parametreleri Fotoçevrim ışık şiddeti ve maruz kalma süresi. Yoğunluğu çok düşükse, Fotoçevrim yavaş ya da hiç ortaya olacaktır. Öte yandan, çok fazla yoğunluk ya da çok uzun süre maruz kaldıklarından protein photobleach ve böylece Fotoçevrim etkinliğini azaltmak.
Bu protokol, pc-FP Fotoçevrim uygulamalar için bir konfokal lazer tarama mikroskobu nasıl kurmak için genel bir yaklaşım açıklanmıştır. İlk olarak, saflaştırılmış protein damlacık numunelerin hazırlanması için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu örnek biçimi mikroskop altında floresan proteinleri photophysical davranış eğitimi için çok uygundur. İkincisi, biz Fotoçevrim için mikroskop nasıl yapılandırılacağı göstermek için protein damlacık örnek kullanabilirsiniz. Ve nihayet, mOrange2 ve Dronpa çift prob, optik vurgulayarak dahil olmak üzere, canlı hücreleri, optik vurgulama nasıl gerçekleştirileceği gösterecektir.
Protocol
Discussion
Saflaştırılmış floresan protein damlacık örnek kinetik ve Fotoçevrim kinetiği photobleaching çalışma örneğin, floresan proteinleri photophysical karakterizasyonu için çok uygun bir örnek biçimidir. Photobleaching ve küvet tabanlı sistemler gerçekleştirmek için zor olabilir Fotoçevrim deneyler, son derece küçük damlacık hacmi (~ 20 picolitre) kolaylaştırır. Buna ek olarak, damlacık örnek ideal Fotoçevrim uygulamalar için bir konfokal mikroskop kurmak için uygundur burada gösterilir. H…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz floresan proteinleri kodlayan plazmid DNA sağlamak için Mike W. Davidson (Florida Eyalet Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma, Sağlık hibe GM72048 (dwp) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
