Photoconversion de protéines purifiées fluorescentes et double-sonde optique dans Soulignant cellules vivantes
Summary
Ce protocole décrit une approche générale pour effectuer photoconversion de protéines fluorescentes sur un microscope confocal à balayage laser. Nous décrivons les procédures de photoconversion d'échantillons de protéines puried, ainsi que pour les bi-sonde optique dans les cellules soulignant vivre avec mOrange2 et Dronpa.
Abstract
Photoconvertible protéines fluorescentes (PC-PC) sont une classe de protéines fluorescentes "surligneur optique" capacité, ce qui signifie que la couleur de la fluorescence peut être changé par l'exposition à la lumière d'une longueur d'onde spécifique. Soulignant optique non invasive permet le marquage d'une sous-population de molécules fluorescentes, et est donc idéal pour le suivi des cellules individuelles ou les organites.
Les paramètres critiques pour les photoconversion efficaces sont l'intensité et la durée d'exposition de la lumière photoconversion. Si l'intensité est trop faible, photoconversion sera lente ou ne se produira pas du tout. D'autre part, l'intensité d'exposition trop ou trop longtemps peut photobleach la protéine et ainsi réduire l'efficacité de photoconversion.
Ce protocole décrit une approche générale comment mettre en place un microscope confocal à balayage laser pour des applications photoconversion PC-PF. Premièrement, nous décrivons une procédure de préparation des échantillons purifiés de gouttelettes de protéines. Ce format de l'échantillon est très pratique pour étudier le comportement photophysiques des protéines fluorescentes sous le microscope. Deuxièmement, nous allons utiliser l'échantillon de gouttelettes de protéines de montrer comment configurer le microscope pour photoconversion. Et enfin, nous allons montrer comment réaliser soulignant optiques dans des cellules vivantes, y compris à double sonde optique avec soulignant mOrange2 et Dronpa.
Protocol
Discussion
Le purifiée échantillon fluorescent gouttelettes de protéines est un exemple de format très pratique pour la caractérisation des protéines fluorescentes photophysiques, par exemple pour étudier la cinétique de photoblanchiment et cinétique photoconversion. Le volume de gouttelettes extrêmement petite (~ 20 picolitres) facilite photoblanchiment et des expériences photoconversion, qui peuvent être difficiles à réaliser dans les systèmes de base cuvette. En outre, comme indiqué ici de l'échantillon des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mike W. Davidson (Florida State University) pour fournir l'ADN plasmidique codant pour des protéines fluorescentes. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde GM72048 (au DWP).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
