Fotoconversione di proteine purificate fluorescenti ed evidenziazione ottica dual-sonda in cellule vive
Summary
Questo protocollo descrive un approccio generale per eseguire fotoconversione di proteine fluorescenti su un microscopio confocale a scansione laser. Si descrivono le modalità per la fotoconversione di campioni di proteine puried, nonché per evidenziare ottici a doppia sonda in cellule vive con mOrange2 e Dronpa.
Abstract
Photoconvertible proteine fluorescenti (pc-PQ) sono una classe di proteine fluorescenti con "ottica evidenziatore" capacità, il che significa che il colore della fluorescenza può essere cambiato l'esposizione alla luce di una specifica lunghezza d'onda. Evidenziando ottico permette la marcatura non invasiva di una sottopopolazione di molecole fluorescenti, ed è quindi ideale per il monitoraggio singole cellule o organuli.
Parametri critici per fotoconversione efficiente sono l'intensità e il tempo di esposizione della luce fotoconversione. Se l'intensità è troppo bassa, fotoconversione sarà lenta o non verificarsi affatto. D'altra parte, l'intensità troppo o troppo a lungo possibile l'esposizione photobleach la proteina e quindi ridurre l'efficienza della fotoconversione.
Questo protocollo descrive un approccio generale come impostare un microscopio confocale a scansione laser per pc-FP applicazioni fotoconversione. In primo luogo, si descrive una procedura per la preparazione di campioni di gocce di proteine purificate. Questo formato campione è molto conveniente per lo studio del comportamento fotofisiche di proteine fluorescenti al microscopio. In secondo luogo, useremo il campione goccia proteina per mostrare come configurare il microscopio per fotoconversione. E, infine, mostreremo come di evidenziare la ottici in cellule vive, inclusa l'evidenziazione ottica dual-sonda con mOrange2 e Dronpa.
Protocol
Discussion
Il campione purificato goccia proteina fluorescente è un formato di campione molto comodo per la caratterizzazione fotofisiche di proteine fluorescenti, ad esempio per studiare photobleaching cinetica e cinetica fotoconversione. Il volume delle gocce estremamente piccole (~ 20 picolitri) facilita photobleaching ed esperimenti fotoconversione, che può essere difficile da eseguire in sistemi basati cuvetta. Inoltre, come mostrato qui il campione goccia è ideale per la creazione di un microscopio confocale per le …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Mike W. Davidson (Florida State University) per aver fornito il DNA plasmide codifica proteine fluorescenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concedere GM72048 (a DWP).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
