Фотопревращения Очищенная флуоресцентных белков и двойного зонда Оптические Выделение в живых клетках
Summary
Этот протокол описывает общий подход для выполнения фотопреобразования флуоресцентных белков по конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Мы описываем процедуры фотопревращения puried образцов белков, а также для двойного зонда оптических подсветка в живых клетках с mOrange2 и Dronpa.
Abstract
Photoconvertible флуоресцентных белков (рс-ФПС) представляют собой класс флуоресцентных белков с "оптический маркер" возможности, а это означает, что цвет флуоресценции может быть изменен под воздействием света определенной длины волны. Оптическая подсветка позволяет неинвазивным маркировка субпопуляции флуоресцентные молекулы, и поэтому идеально подходит для отслеживания отдельных клеток или органелл.
Критические параметры для эффективного фотопреобразования являются интенсивность и время экспозиции фотопреобразования света. Если интенсивность слишком мала, фотопреобразования будет медленно или не происходит вообще. С другой стороны, слишком много интенсивности или слишком длительном воздействии может photobleach белка и тем самым снизить эффективность фотопреобразования.
Этот протокол описывает общий подход, как настроить конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для ПК-FP приложений фотопреобразования. Во-первых, мы описываем процедуру подготовки очищенные образцы белка капли. Этот образец формат очень удобен для изучения фотофизических поведение флуоресцентных белков под микроскопом. Во-вторых, мы будем использовать образец белка капли, чтобы показать, как настроить микроскоп для фотопреобразования. И, наконец, мы покажем, как выполнить оптическую подсветку в живых клетках, в том числе двойного зонда оптических выделение с mOrange2 и Dronpa.
Protocol
Discussion
Очищенной люминесцентные образцы капли белка очень удобно типовой формат для фотофизических характеристик флуоресцентные белки, например, для исследования кинетики и фотообесцвечивания фотопреобразования кинетики. Крайне мало объема капли (~ 20 пиколитра) облегчает фотообесцвечива?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим В. Майк Дэвидсон (Университет штата Флорида) за предоставление плазмиды ДНК, кодирующий флуоресцентные белки. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант GM72048 (для ДПР).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
