Photoconversion renat fluorescerande proteiner och Dual-probe optisk markering i levande celler
Summary
Detta protokoll beskriver en allmän strategi för att utföra photoconversion av fluorescerande proteiner på en konfokala laserskanning mikroskop. Vi beskriver förfaranden för photoconversion av puried protein prover, samt för dual-sond optisk lyfta i levande celler med mOrange2 och Dronpa.
Abstract
Photoconvertible fluorescerande proteiner (PC-FPS) är en klass av fluorescerande proteiner med "optisk överstrykningspenna" funktion, vilket innebär att färgen på fluorescensen kan ändras av exponering för ljus av en viss våglängd. Optisk lyfta möjliggör noninvasiv märkning av en subpopulation av fluorescerande molekyler, och är därför idealisk för att spåra enskilda celler eller organeller.
Kritiska parametrar för effektiv photoconversion är intensiteten och exponeringstiden för photoconversion ljus. Om intensiteten är för låg, kommer photoconversion vara långsam eller inte förekomma alls. Å andra sidan kan för mycket intensitet eller för lång exponering photobleach proteinet och därmed minska effektiviteten i photoconversion.
Detta protokoll beskriver en allmän riktlinje hur man ställer in en konfokala laserscanning mikroskop för PC-FP photoconversion applikationer. Först beskriver vi en ordning för beredning renat prover protein droppe. Detta prov formatet är mycket bekvämt för att studera fotofysiska beteende fluorescerande proteiner under mikroskop. För det andra kommer vi att använda provet proteinet droppen för att visa hur man konfigurerar mikroskop för photoconversion. Och slutligen, visar vi hur du utför optisk lyfta i levande celler, inklusive dubbla givare optiska markera med mOrange2 och Dronpa.
Protocol
Discussion
Det renade fluorescerande proteinet droppe prov är ett mycket praktiskt prov format för fotofysiska karakterisering av fluorescerande proteiner, till exempel att studera fotoblekning kinetik och kinetik photoconversion. Den extremt liten droppe volym (~ 20 pikoliter) underlättar fotoblekning och experiment photoconversion, vilket kan vara svårt att utföra i kyvett-baserade system. Dessutom, som visas här droppen provet är idealisk för att inrätta ett konfokalmikroskop för photoconversion applikationer. Den hyd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Mike W. Davidson (Florida State University) att ställa plasmid-DNA-kodning fluorescerande proteiner. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag GM72048 (till DWP).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
