Summary
Metoden som presenteras här kan utvärdera effekten av reagenser på angiogenes eller vaskulär permeabilitet in vivo utan färgning. Metoden använder dextran-FITC-injektion via svansvenen för att visualisera neo-kärl eller vaskulärt läckage.
Abstract
Flera modeller har utvecklats för att undersöka angiogenes in vivo. De flesta av dessa modeller är dock komplexa och dyra, kräver specialutrustning eller är svåra att utföra för efterföljande kvantitativ analys. Här presenterar vi en modifierad matrisgelpluggsanalys för att utvärdera angiogenes in vivo. I detta protokoll blandades vaskulära celler med matrixgel i närvaro eller frånvaro av pro-angiogena eller antiangiogena reagenser och injicerades sedan subkutant i ryggen på mottagarmöss. Efter 7 dagar injiceras fosfatbuffertsaltlösning innehållande dextran-FITC via svansvenen och cirkuleras i kärl i 30 minuter. Matrix-gelpluggar samlas in och bäddas in med vävnadsinbäddningsgel, sedan skärs 12 μm sektioner för fluorescensdetektering utan färgning. I denna analys kan dextran-FITC med hög molekylvikt (~150 000 Da) användas för att indikera funktionella kärl för att detektera deras längd, medan dextran-FITC med låg molekylvikt (~4 400 Da) kan användas för att indikera permeabiliteten hos neokärl. Sammanfattningsvis kan detta protokoll ge en tillförlitlig och bekväm metod för kvantitativ studie av angiogenes in vivo.
Introduction
Angiogenes, processen för bildning av neo-kärl från redan existerande kärl, spelar en avgörande roll i många fysiologiska och patologiska processer, såsom embryonal utveckling, sårläkning, åderförkalkning, tumörutveckling, etc.1,2,3,4,5. Denna dynamiska process involverar flera steg, inklusive nedbrytning av matrisen, vaskulär cellproliferation, migration och självorganisering för att bilda rörformiga strukturer och stabilisering av neo-kärlen6. Att främja angiogenes har visat sig vara avgörande vid behandling av hjärtinfarkt, stroke och andra typer av ischemiska sjukdomar7 medan hämning av angiogenes har ansetts vara en lovande strategi vid behandling av cancer8 och reumatiska sjukdomar9. Angiogenes har ansetts vara en organiserande princip för läkemedelsupptäckt10. Således är konstruktionen av en tillförlitlig och bekväm metod för att bedöma omfattningen av angiogenes avgörande för mekanisk forskning eller läkemedelsupptäckt vid angiogenesberoende sjukdomar.
Flera in vitro- och in vivo-modeller har utvecklats för att utvärdera angiogenes11. Bland dessa kan tvådimensionella (2-D) modeller, som matrisgelrörsbildningsanalys12, inte bilda funktionella rörformiga strukturer. Djurmodellerna, såsom bakbensischemi modell13,14, kan reproducera angiogenesprocessen men är komplexa och kräver ett laserfläckigt blodflödesavbildningssystem. 3D-modeller av vaskulär morfogenes, som matrisgelplugganalys, ger en enkel plattform som kan efterlikna processen för angiogenes in vivo15, men detektionen av angiogenes kräver immunhistokemi eller immunofluorescensfärgning 16,17,18, som är variabla och dåligt visualiserade.
Här beskriver vi ett protokoll för en modifierad matrisgelpluggsanalys där vaskulära celler blandades med matrisgel och subkutant injicerades i ryggen på möss för att bilda en plugg. I pluggen måste kärlceller bryta ner matrisen, föröka sig, migrera och självorganisera sig för att slutligen bilda funktionella kärl med blodflöde i den inre miljön. Därefter injiceras fluorescerande märkt dextran via svansvenen, för att flöda genom pluggen, och etiketten visualiseras för att indikera neo-kärl. Innehållet av angiogenes kan utvärderas kvantitativt genom kärlens längd. Denna metod kan bilda funktionella kärl som inte kan produceras i 2-D angiogenesmodeller12 och behöver inte komplex färgningsprocess som i vanlig matrisgelplugganalys11. Det kräver inte heller dyra specifika instrument som laserspeckel blodflödesavbildningssystem i bakbensischemi modell 13,14,19. Denna metod är mångsidig, billig, kvantifierbar och lätt att utföra, och kan användas för att bestämma den pro- eller antiangiogena förmågan hos läkemedel eller användas i mekanisk forskning som är involverad i angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som involverar djurförsökspersoner godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 juli 2021). Alla reagenser och förbrukningsvaror listas i materialförteckningen.
1. Beredning av odlingsmedium
- 10x M199 odlingsmedium: Lös upp M199-pulver till 10x koncentration med 90 ml avjoniserat vatten och tillsätt 10 ml fetalt bovint serum (FBS), passera sedan genom ett 0,22 μm filter. Förvara mediet vid 4 °C i upp till 2 månader.
- Komplett endotelodlingsmedium: Tillsätt 50 ml FBS, 5 ml penicillin/streptomycin och 5 ml endotelcellstillväxttillskott till 460 ml endotelcellsmedium (ECM). Förvara mediet vid 4 °C i upp till 1 månad.
2. Beredning av kärlceller
- Odling 1 x 105 kärlceller (primära odlade endotelprogenitorceller14, endotelceller eller endotelcellinjer) med 8 ml komplett endotelodlingsmedium i 100 mm vävnadsodlingsskål vid 37 °C och 5 % CO2 till 70 % sammanflöde.
- Ta bort odlingsmediet och skölj skålen 2x med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att ta bort ofästa celler och skräp. Ta bort PBS och tillsätt 3 ml 0,25 % trypsin innehållande 2,21 mM EDTA och inkubera vid 37 °C i 1 min.
- Neutralisera trypsinet med 7 ml komplett endotelodlingsmedium och skölj försiktigt bort cellerna från odlingsskålen. Bekräfta celllossning under ett ljusmikroskop (40x förstoring).
- Samla cellsuspensionen i ett 15 ml rör och centrifugera vid 400 x g i 10 minuter. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 5 ml komplett endotelodlingsmedium.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och flytta suspensionen innehållande 2 x 106 celler till ett sterilt 1,5 ml rör. Varje plugg innehåller 1,5 x 106 celler, ytterligare 25% celler används vid avfall. Varje grupp innehåller minst 3 pluggar.
OBS: Efter försök visade det sig att 1,5 x 106 celler i 300 μL matrisgel ledde till korrekt utveckling av angiogenes och valdes därför ut för experiment. - Centrifugera cellsuspensionen vid 400 x g i 5 minuter till pelletcellerna och avlägsna sedan supernatanten.
3. Beredning av matrisgel
- Förkyl sterila 1,5 ml rör som innehåller cellpellets i ett 4 °C vattenbad. Kyl 30 G insulinsprutor på 1 ml i kylskåp med 4 °C.
- Tina matrisgelen helt i ett 4 °C vattenbad. Blanda eller virvla inte. Förkyl 10x M199 och testa reagens/läkemedel i ett 4 °C vattenbad.
- Blanda förkyld matrisgel med 10x M199 som innehåller 10 % FBS och reagenset som ska testas vid ett volymförhållande på 8,8:1:0,2 för att få en matrisgel och M199-blandning som innehåller 1 % FBS och reagensen.
- Återsuspendera cellerna med 400 μL av matrisgelblandningen, blanda försiktigt för att undvika att bubblor bildas. Håll slangen på is tills mössen är förberedda för injektion. Håll matrisgelblandningen på is hela tiden för att undvika koagulering.
OBS: Här användes 300 μL matrisgelblandning innehållande 1,5 x 106 celler för att bilda gelplugg. Förbered 25 % extra gel enligt 25 % extra celler i steg 2.
4. Förberedelse av mus
- Bedöva 6-8 veckor gamla Nu/Nu-mushanar (18-25 g) i anestesiapparatens kammare med isofluran (3 % isofluran i 100 % syre vid en flödeshastighet på 1 L/min). Efter lyckad anesövning, bekräftad av frånvaron av rätningsreflex och tånypreflex, flytta musen ut ur kammaren, flytta musen ut ur kammaren och sätt en anestesimell på musen och ändra koncentrationen av isofluran till 1,5 % i 100 % syre vid en flödeshastighet på 1 l/min.
OBS: Ge termiskt stöd till djuret med hjälp av en värmedyna under hela proceduren. - Använd veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet. Tejpa mössens lemmar på manöverkortet i bukläge.
5. Injektion av matrisgelblandning
- Fyll på 300 μL av matrisgelblandningen i en 1 ml insulinspruta med en 30G nål. Undvik bubbelbildning. Ladda matrisgelen snabbt (inom 2 minuter) för att undvika stelning under denna tid. Placera omedelbart insulinsprutan laddad med matrixgel på is.
- Rengör huden på mössens rygg med 75 % alkoholkuddar. Injicera subkutant 300 μl matrisgelblandning i ena sidan av ryggen på möss.
- Dra försiktigt bort nålen från injektionsstället för att förhindra läckage av matrisgelblandningen. Kontrollera om det finns en liten puckel vid injektionsstället (Figur 1).
- Placera musen på värmedynan i 2 minuter för att låta matrisgelblandningen koagulera och bilda plugg.
- Upprepa steg 5.2. till 5.4. för att skapa kontakt på andra sidan av musens baksida. Markera kanterna på pucklarna med en tuschpenna.
- Observera musen tills den har återfått tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande. Sätt musen i en separat bur tills den är helt återställd. Inhyss mössen i SPF-klassat experimentellt djurlaboratorium vid 22 ± 2 °C med en 12 timmars ljus/mörker-cykel i 7 dagar.
6. Dextran-FITC injektion genom svansvenen
- Efter 7 dagars injektion av matrixgel återsuspenderas 0,5 mg dextran-FITC med 500 μl dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och virvlas sedan våldsamt för att erhålla dextran-FITC-lösningen vid den slutliga koncentrationen av 1 μg/μL.
OBS: Använd dextran-FITC med molekylvikt på ~150 kDa för angiogenesanalys och använd dextran-FITC med molekylvikt på ~4 kDa för vaskulär permeabilitetsanalys. - Fyll på 50 μl dextran-FITC-lösning i 29G-sprutorna.
- Fäst musen på svansvenens injektionsinstrument. Rengör svansen med en bomullstuss med 75 % alkohol och injicera försiktigt 50 μL dextran-FITC genom svansvenen.
- Tryck ihop injektionsstället med en bomullspinne i 1 minut för att stoppa blödningen och sätt sedan tillbaka mössen i buren i 30 minuter.
- Upprepa steg 6.3. och 6.4. tills alla möss har fått dextran-FITC-injektion.
7. Matris gelplugg samling
- Injicera intraperitonealt 1 % pentobarbitalnatrium i PBS (200 mg/kg kroppsvikt) och avliva mössen med en IACUC-godkänd procedur.
- Klipp huden längs den markerade kanten på pluggen med en kirurgisk sax och ta bort huden ovanför matrisgelpluggen.
- Samla upp pluggen och skölj i en liten bägare med 1x PBS för att tvätta bort överflödigt blod (Figur 2A). Färgen på pluggen kan grovt avgränsa graden av blodförekomst och innehållet i neo-kärl (Figur 3A).
8. Inbäddning av matrisgelplugg och sektionsförberedelse
- Täck knappen på vävnadsinbäddningskassetten med cirka 0.5 ml vävnadsinbäddningsgel, placera sedan omedelbart matrisgelpluggen på vävnadsinbäddningsgelen i önskad riktning som visas i figur 2B. Bädda sedan in pluggen med ytterligare vävnadsinbäddningsgel.
- Sätt kassetterna i en frys på -80 °C i 12 timmar för att stelna.
- För förberedelse av tjocka sektioner, ta ut det stelnade pluggblocket och skär 12 μm tjocka sektioner med frysmikrotomen enligt instruktionerna och montera på objektglas.
- Skär 5-10 sektioner från varje pluggblock.
9. Kvantifiering av angiogenes (figur 3)
- Ta fluorescensbilder från 5 oberoende fält i sektionen med ett inverterat fluorescensmikroskop vid 488 nm våglängd under 10x förstoring.
- Öppna bildfilen med programvaran Image J (https://imagej.en.softonic.com/) och klicka på knappen Angiogenesis Analyze . Klicka sedan på knappen Analysera HUVEC faskontrast och växla till Stat Results Table för att samla in information. Mät alla 5 tagna fluorescensbilder för varje sektion.
- Analysera den totala längden av neo-kärl från olika grupper för att statistiskt utvärdera skillnaden i angiogenes mellan dessa grupper.
OBS: Total längd på mastersegment anger den totala längden på neo-fartyg. Reagenset som ökar längden på neo-kärl kallas pro-angiogent, medan reagenset som minskar längden på neo-kärl är antiangiogent.
10. Kvantifiering av vaskulär permeabilitet (figur 4)
- Ta fluorescensbilder från 5 oberoende fält i sektionen med ett inverterat fluorescensmikroskop vid 488 nm våglängd under 20x förstoring.
- Öppna bildfilen med programvaran Image J. Klicka på knappen Frihandsval och ringa in läckageområdet, klicka sedan på menyn Analysera och välj alternativet Mät för att få områdesinformation om läckageområdet. Använd förhållandet mellan läckagearea och bildarea för att indikera vaskulär permeabilitet.
- Analysera förhållandet mellan läckagearea och bildarea från olika grupper för att statistiskt utvärdera skillnaden i vaskulär permeabilitet mellan dessa grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 är flödesschemat som visar hur man bereder blandningen av matrisgel, kärlceller, odlingsmedium och reagens. Blandningen injicerades sedan subkutant i ryggen på Nu/Nu-möss och värmdes upp med hjälp av en värmedyna för att påskynda koaguleringen för att slutligen bilda gelplugg.
Figur 2A är flödesschemat för att indikera kärl med fluorescerande märkt dextran. Fluorescerande märkt dextran injicerades via svansvenen och cirkeln i 30 minuter, så att det kan komma in i det funktionella kärlet i gelpluggen. Därefter samlades gelpluggarna in och bäddades in med hjälp av vävnadsinbäddningsgel (orienteringen av matrisgelen när den var inbäddad indikerades i figur 2B). En 12 μm tjock sektion skars ut från pluggarna (5 skivor från varje sida) och fluorescerande bilder togs för kvantitativ analys av angiogenes och/eller vaskulär permeabilitet.
Figur 3 visar inverkan av antiangiogent reagenspalmitat och proangiogent reagens fibroblasttillväxtfaktor 1 (FGF1) på angiogenes i gelpluggen. Figur 3A är utseendet på gelproppar med vehikel, palmitat eller FGF1. Blod kan komma in i det funktionella neokärlet i gelpluggen, vilket gör proppen röd i varierande grad. Figur 3B är den fluorescerande bilden av matrixgelpluggar, där de funktionella kärlen visualiserades med dextran-FITC med hög molekylvikt. Figur 3C är det kvantitativa resultatet av fartygslängden för olika grupper. Palmitat kan avsevärt minska längden på neo-kärl, medan FGF1-behandling uppenbarligen kan öka längden.
I figur 4 jämförs den vaskulära permeabiliteten i gelpluggar med eller utan behandling med vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Figur 4A är den fluorescerande bilden av matrixgelpluggar, där läckageområdet visualiseras av dextran-FITC med låg molekylvikt och indikeras med pilar. Figur 4B är det kvantitativa resultatet av läckagearea. Den ökade läckagearean i VEGF-behandlingsgruppen avslöjade att VEGF kan öka vaskulär permeabilitet.
Figur 1. Flödesschema som visar bildandet av en gelpropp hos möss. Kärlceller odlade i monolagerodling dissocieras, pelleteras, resuspenderas med endotelcellsmedium (ECM) och räknas (I-IV). Efter pelletering och resuspension i matrisgelblandning (innehållande 8,8 volyms matrixgel, 1 volym 10x M199 kompletterad med 10 % FBS och 0,2 volymreagens) injicerades 300 μl gelblandning subkutant i mössens baksida (V-VII) för att bilda proppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Flödesschema som visar dextran-FITC-injektion och kvantifiering av angiogenes. (A) Dextran-FITC injicerades via svansvenen (I). Efter 30 minuter togs gelpluggen, bäddades in och sektionerna skivades med frysmikrotom (II, III). Därefter togs fluorescensbilder med hjälp av fluorescensmikroskop (IV) och angiogenes analyserades kvantitativt med hjälp av Image J-programvaran (V). (B) Diagrammet över matrisgelpluggens orientering när den är inbäddad i vävnadsinbäddningskassett. Förkortningar: OCT = optimal skärtemperaturförening. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Utvärdering av angiogenes med hjälp av modifierad matrisgelplugganalys. (A) Utseende av representativa matrixgelpluggar. (B) Den fluorescerande bilden av funktionella kärl i matrixgelpluggar indikerad av Dextran-FITC. C) Kvantitativ analys av längden på funktionella kärl i matrixgelpluggar med envägs ANOVA. *p<0,05 jämfört med fordon; p<0,001 jämfört med fordon. Skalstapeln är 100 μm. Förkortningar: FGF1 = Fibroblasttillväxtfaktor 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Utvärdering av vaskulär permeabilitet med hjälp av modifierad matrisgelplugganalys. (A) Den representativa fluorescensbilden av kärl i gelplugg, pilarna indikerar läckageställe. (B) Kvantitativ analys av läckagearea för att utvärdera vaskulär permeabilitet med hjälp av Students t-test. s<0.001. Skalstapeln är 100 μm. Förkortningar: VEGF = vaskulär endotelial tillväxtfaktor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar en tillförlitlig och bekväm metod för kvantitativ utvärdering av angiogenes in vivo utan färgning. I detta protokoll blandades vaskulära celler med matrixgel i närvaro av pro-angiogena eller antiangiogena reagenser och injicerades sedan subkutant i ryggen på Nu/Nu-möss för att bilda gelplugg (Figur 1). Efter 7 dagars gelpluggsbildning injicerades dextran-FITC intravenöst och cirkulerades i 30 minuter. Gelpluggen samlades in och bäddades in med vävnadsinbäddningsgel, och 12 μm sektioner skars för fotografering (figur 2). Dextran-FITC kan indikera funktionella kärl utan färgning, och längden på neo-kärl kan användas för att kvantitativt utvärdera den pro-angiogena eller antiangiogena funktionen hos reagens. I exemplet som presenteras i detta protokoll minskade palmitatbehandling längden på neokärlen, medan FGF1 ökade längden på neokärlen (Figur 3), vilket indikerade att palmitat är antiangiogent, medan FGF1 är proangiogent. Utöver det kan detta protokoll också användas vid utvärdering av vaskulär permeabilitet (Figur 4).
Försiktighet bör iakttas vid val av mottagarmöss, hantering och injektion av matrixgelen, uppsamling av gelplugg och detektering av kärlens längd. Möss med immunbrist i åldern 6-8 veckor rekommenderas, även om C57BL/6-möss också är användbara. Med tanke på variationen i pluggen rekommenderas 3-5 pluggar i varje grupp. Antalet kärlceller ska vara jämnt mellan olika grupper. Matrixgel ska hanteras försiktigt enligt instruktionerna och ska inte användas om den stelnat eller innehåller partiklar eller många bubblor. I beredningssteget för matrisgel bör den slutliga koncentrationen av matrisgel inte vara mindre än 80 %, och virvel är inte tillåten eftersom bubblor kan bildas. Det bör noteras att formen på gelpluggen kan påverka resultatens reproducerbarhet, så värmedynan användes för att påskynda stelningen av matrisgelpluggen. En 37 °C djurinkubator kan också användas. Dessutom bör pluggar och sektioner skyddas mot starkt ljus under inbäddning av gelpluggar och sektionsförberedelser, och foton bör tas under ett fluorescensmikroskop så snart som möjligt.
Bland de olika in vivo-angiogenesanalyserna är matrisgelplugganalysen en av de mest använda metoderna eftersom den är mångsidig, billigare och lätt att utföra11. Färgningsprocessen i vanlig matrisgelplugganalys är dock felbenägen. Pluggen är ömtålig och med hög vattenhalt. De dehydrerings- och fixeringssteg som ingår i färgningsprocessen kan förvränga gelpluggen och ytterligare påverka utvärderingen av kärlens längd. Dessutom kan de spridda kärlcellerna i pluggen färgas och kännas igen som funktionella kärl i vanlig matrisgelplugganalys. En av de viktigaste fördelarna med denna modifierade matrisgelplugganalys är att de funktionella kärlen kan visualiseras utan färgning. FITC-märkt dextran användes för att indikera kärl, och endast funktionella kärl som har blodflöde kan indikeras, vilket bidrar till bekvämligheten och tillförlitligheten hos denna analys.
Förutom längden på neo-kärl påverkar permeabiliteten också neo-kärlens funktion20. Fluorescerande märkt dextran med låg molekylvikt (~4 400 Da) kan passera genom gapet i kärl och kan användas för att indikera permeabiliteten hos neokärl. Vid behov kan forskarna utvärdera både angiogenes och vaskulär permeabilitet i samma gelplugg genom att använda både fluorescerande märkt dextran med låg molekylvikt och dextran med hög molekylvikt21.
Angiogenes kan påverkas av in vivo-miljön 22, såsom diabetes 13,14,19, etc. Denna in vivo-miljö är svår att reproducera i dessa in vitro-modeller. I detta modifierade protokoll kan dock in vivo-miljön enkelt reproduceras genom att välja rätt mottagarmöss. Dessutom påverkar interaktionen mellan olika kärlceller också angiogenesprocessen. Olika typer av kärlceller, inklusive endotelceller, glatta muskelceller och pericyter, kan läggas till för att bilda neo-kärl i pluggen i detta protokoll för att undersöka bidraget från olika vaskulära celler i angiogenes.
Det finns dock också vissa begränsningar för denna metod. Bildandet av neo-kärl kan påverkas av gelpluggens form. Dessutom är neo-kärlen som bildas i gelpluggen inte jämna. Det finns fler funktionella kärl vid kanten av gelpluggen än den i mitten (Figur 2A). Således kan resultaten påverkas av artistens skicklighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY22H020005) och National Natural Science Foundation of China (81873466).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
