Summary
يمكن للطريقة المعروضة هنا تقييم تأثير الكواشف على تكوين الأوعية الدموية أو نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي دون تلطيخ. تستخدم الطريقة حقن ديكستران-FITC عبر الوريد الخلفي لتصور الأوعية الجديدة أو تسرب الأوعية الدموية.
Abstract
تم تطوير العديد من النماذج للتحقيق في تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن معظم هذه النماذج معقدة ومكلفة ، وتتطلب معدات متخصصة ، أو يصعب تنفيذها للتحليل الكمي اللاحق. نقدم هنا مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة لتقييم تكوين الأوعية في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، تم خلط الخلايا الوعائية مع هلام المصفوفة في وجود أو عدم وجود كواشف مؤيدة لتولد الأوعية أو مضادة لتولد الأوعية ، ثم حقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران المتلقية. بعد 7 أيام ، يتم حقن محلول ملحي عازل للفوسفات يحتوي على ديكستران-FITC عبر الوريد الذيلي ويتم تدويره في أوعية لمدة 30 دقيقة. يتم جمع سدادات هلام المصفوفة ودمجها مع هلام تضمين الأنسجة ، ثم يتم قطع أقسام 12 ميكرومتر للكشف عن التألق دون تلطيخ. في هذا الفحص ، يمكن استخدام dextran-FITC ذو الوزن الجزيئي العالي (~ 150000 Da) للإشارة إلى الأوعية الوظيفية للكشف عن طولها ، بينما يمكن استخدام dextran-FITC ذات الوزن الجزيئي المنخفض (~ 4400 Da) للإشارة إلى نفاذية الأوعية الجديدة. في الختام ، يمكن أن يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة ومريحة للدراسة الكمية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي.
Introduction
يلعب تكوين الأوعية ، عملية تكوين الأوعية الجديدة من الأوعية الموجودة مسبقا ، دورا مهما في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل التطور الجنيني ، والتئام الجروح ، وتصلب الشرايين ، وتطور الورم ، وما إلى ذلك 1،2،3،4،5. تتضمن هذه العملية الديناميكية عدة خطوات ، بما في ذلك تدهور المصفوفة ، وتكاثر الخلايا الوعائية ، والهجرة والتنظيم الذاتي لتشكيل هياكل أنبوبية وتثبيت الأوعية الجديدة6. ثبت أن تعزيز تكوين الأوعية أمر بالغ الأهمية في علاج احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية وأنواع أخرى من الأمراض الإقفارية7 بينما يعتبر تثبيط تكوين الأوعية استراتيجية واعدة في علاج السرطانات8 وأمراض الروماتويد9. يعتبر تكوين الأوعية مبدأ تنظيميا لاكتشاف الأدوية10. وبالتالي ، فإن بناء طريقة موثوقة ومريحة لتقييم مدى تكوين الأوعية أمر بالغ الأهمية للبحث الميكانيكي أو اكتشاف الأدوية في الأمراض التي تعتمد على تولد الأوعية.
تم تطوير العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي لتقييم تولد الأوعية11. من بين هذه النماذج ، لا يمكن للنماذج ثنائية الأبعاد (2-D) ، مثل فحص تشكيل أنبوب هلامالمصفوفة 12 ، تشكيل هياكل أنبوبية وظيفية. يمكن للنماذج الحيوانية ، مثل نموذج نقص تروية الطرف الخلفي13،14 ، إعادة إنتاج عملية تكوين الأوعية ولكنها معقدة وتتطلب نظام تصوير تدفق الدم بالليزر البقعي. توفر النماذج ثلاثية الأبعاد لتشكل الأوعية الدموية ، مثل مقايسة سدادة هلام المصفوفة ، منصة بسيطة يمكنها تقليد عملية تكوين الأوعية في الجسم الحي15 ، لكن اكتشاف تكوين الأوعية يتطلب الكيمياء المناعية أو تلطيخ التألق المناعي16،17،18 ، وهي متغيرة وسيئة التصور.
هنا ، نصف بروتوكولا لمقايسة سدادة هلام المصفوفة المعدلة حيث تم خلط خلايا الأوعية الدموية مع هلام المصفوفة وحقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران لتشكيل سدادة. في السدادة ، تحتاج الخلايا الوعائية إلى تحلل المصفوفة ، والتكاثر ، والهجرة ، والتنظيم الذاتي لتشكيل أوعية وظيفية في النهاية مع تدفق الدم في البيئة الداخلية. بعد ذلك ، يتم حقن ديكستران المسمى بالفلورسنت عبر الوريد الخلفي ، ليتدفق عبر القابس ، ويتم تصور الملصق للإشارة إلى الأوعية الجديدة. يمكن تقييم محتوى تولد الأوعية كميا من خلال طول الأوعية. يمكن أن تشكل هذه الطريقة أوعية وظيفية لا يمكن إنتاجها في نماذج تولد الأوعية ثنائية الأبعاد12 ، ولا تحتاج إلى عملية صبغ معقدة كما هو الحال في مقايسة سدادة هلام المصفوفةالعادية 11. كما أنه لا يتطلب أدوات محددة باهظة الثمن مثل نظام تصوير تدفق الدم بالليزر في نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية13،14،19. هذه الطريقة متعددة الاستخدامات ومنخفضة التكلفة وقابلة للقياس الكمي وسهلة الأداء ، ويمكن استخدامها لتحديد القدرة المؤيدة أو المضادة لتولد الأوعية الدموية للأدوية أو استخدامها في الأبحاث الميكانيكية المشاركة في تكوين الأوعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة ونتشو الطبية (XMSQ2021-0057 ، 19 يوليو 2021). يتم سرد جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية في جدول المواد.
1. إعداد وسط الثقافة
- 10x M199 وسط الاستزراع: قم بإذابة مسحوق M199 إلى تركيز 10x مع 90 مل من الماء منزوع الأيونات وأضف 10 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، ثم مرر عبر مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين الوسط في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
- وسط زراعة بطانة كاملة: أضف 50 مل من FBS ، و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 5 مل من مكمل نمو الخلايا البطانية إلى 460 مل من وسط الخلايا البطانية (ECM). قم بتخزين الوسط في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
2. إعداد خلايا الأوعية الدموية
- زراعة 1 × 105 خلايا وعائية (الخلايا السلفية البطانية الأوليةالمستزرعة 14 ، الخلايا البطانية ، أو خطوط الخلايا البطانية) مع 8 مل من وسط زراعة البطانة الكامل في طبق زراعة الأنسجة 100 مم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 إلى 70٪ التقاء.
- قم بإزالة وسط الاستزراع وشطف الطبق 2x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) لإزالة الخلايا غير المرتبطة والحطام. إزالة PBS وإضافة 3 مل من 0.25٪ تربسين يحتوي على 2.21 مليمتر EDTA ، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- قم بتحييد التربسين ب 7 مل من وسط الثقافة البطانية الكامل ، واشطف الخلايا برفق من طبق الاستزراع. تأكيد انفصال الخلايا تحت المجهر الضوئي (تكبير 40x).
- جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 دقائق. إزالة طاف وإعادة تعليق الخلايا مع 5 مل من وسط الثقافة البطانية الكامل.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وانقل المعلق الذي يحتوي على 2 × 106 خلايا إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل. يحتوي كل قابس على 1.5 × 106 خلايا ، وتستخدم خلايا إضافية بنسبة 25٪ في حالة النفايات. تتضمن كل مجموعة 3 مقابس على الأقل.
ملاحظة: بعد التجارب وجد أن 1.5 × 106 خلايا في 300 ميكرولتر من هلام المصفوفة أدت إلى التطور السليم لتكوين الأوعية وبالتالي تم اختيارها للتجريب. - تعليق خلية الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق لخلايا الحبيبات ، ثم إزالة المادة الطافية.
3. إعداد هلام ماتريكس
- قم بتبريد أنابيب معقمة سعة 1.5 مل تحتوي على حبيبات خلوية في حمام مائي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية. قم بتبريد محاقن الأنسولين 30 جم سعة 1 مل في ثلاجة 4 درجات مئوية.
- قم بإذابة جل المصفوفة تماما في حمام مائي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية. لا تخلط أو دوامة. قم بتبريد 10x M199 مسبقا واختبر الكاشف / الدواء محل الاهتمام في حمام مائي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية.
- امزج جل المصفوفة المبرد مسبقا مع 10x M199 الذي يحتوي على 10٪ FBS والكاشف المراد اختباره بنسبة حجم 8.8: 1: 0.2 للحصول على هلام مصفوفة وخليط M199 يحتوي على 1٪ FBS والكاشف.
- أعد تعليق الخلايا ب 400 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة ، واخلطها برفق لتجنب تكوين فقاعات. احتفظ بالأنبوب على الثلج حتى يتم تحضير الفئران للحقن. احتفظ بخليط هلام المصفوفة على الثلج طوال الوقت لتجنب التخثر.
ملاحظة: هنا ، تم استخدام 300 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة الذي يحتوي على 1.5 × 106 خلايا لتشكيل سدادة هلام. تحضير 25٪ جل إضافي وفقا ل 25٪ خلايا إضافية في الخطوة 2.
4. إعداد الماوس
- تخدير ذكر الفأر Nu / Nu البالغ من العمر 6-8 أسابيع (18-25 جم) في غرفة جهاز تخدير باستخدام الأيزوفلوران (3٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة). بعد التخدير الناجح ، الذي يؤكده عدم وجود منعكس تصحيح ومنعكس قرصة إصبع القدم ، حرك الماوس خارج الغرفة ، وحرك الماوس خارج الغرفة وضع قناع تخدير على الماوس وقم بتغيير تركيز الأيزوفلوران إلى 1.5٪ في الأكسجين بنسبة 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة.
ملاحظة: توفير الدعم الحراري للحيوان باستخدام وسادة التدفئة طوال العملية. - استخدم مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف. الشريط أطراف الفئران على لوحة العمليات في وضع الانبطاح.
5. حقن خليط هلام ماتريكس
- قم بتحميل 300 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة في حقنة أنسولين سعة 1 مل بإبرة 30 جرام. تجنب تكوين الفقاعة. قم بتحميل هلام المصفوفة بسرعة (في غضون 2 دقيقة) لتجنب التصلب خلال هذا الوقت. ضع حقنة الأنسولين المحملة بهلام ماتريكس على الثلج على الفور.
- تنظيف الجلد على ظهر الفئران باستخدام منصات الكحول 75 ٪. حقن تحت الجلد 300 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة في جانب واحد من الجزء الخلفي من الفئران.
- قم بإزالة الإبرة برفق من موقع الحقن لمنع تسرب خليط هلام المصفوفة. تحقق من وجود سنام صغير في موقع الحقن (الشكل 1).
- ضع الماوس على وسادة التسخين لمدة 2 دقيقة للسماح لخليط هلام المصفوفة بالتخثر وتشكيل القابس.
- كرر الخطوات 5.2. إلى 5.4. لإنشاء قابس على الجانب الآخر من الجزء الخلفي من الماوس. ضع علامة على حواف الحدبات باستخدام قلم تمييز.
- راقب الفأر حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. ضع الماوس في قفص منفصل حتى يتم استرداده بالكامل. إيواء الفئران في مختبر التجارب من فئة SPF في 22 ± 2 درجة مئوية مع دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة لمدة 7 أيام.
6. حقن ديكستران-FITC من خلال الوريد الذيل
- بعد 7 أيام من حقن هلام المصفوفة، أعد تعليق 0.5 ملغ من ديكستران-فيتسي مع 500 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) ثم دوامة عنيفة للحصول على محلول ديكستران-FITC عند التركيز النهائي 1 ميكروغرام/ميكرولتر.
ملاحظة: استخدم ديكستران-FITC بوزن جزيئي ~ 150 كيلو دالتون لمقايسة تكوين الأوعية ، واستخدم ديكستران-FITC بوزن جزيئي ~ 4 كيلو دالتون لمقايسة نفاذية الأوعية الدموية. - قم بتحميل 50 ميكرولتر من محلول ديكستران-FITC في محاقن 29G.
- إصلاح الماوس على أداة حقن الوريد الذيل. نظف الذيل بكرة قطنية كحولية بنسبة 75٪ وحقن 50 ميكرولتر من ديكستران-FITC برفق عبر وريد الذيل.
- ضغط موقع الحقن بقطعة قطن لمدة 1 دقيقة لوقف النزيف ، ثم أعد الفئران إلى القفص لمدة 30 دقيقة.
- كرر الخطوات 6.3. و 6.4. حتى تتلقى جميع الفئران حقن ديكستران-FITC.
7. مجموعة المكونات هلام ماتريكس
- حقن 1٪ من صوديوم بنتوباربيتال داخل الصفاق في برنامج تلفزيوني (200 ملغم / كغم من وزن الجسم) والقتل الرحيم للفئران بإجراء معتمد من IACUC.
- قطع الجلد على طول الحدود المحددة للقابس باستخدام مقص جراحي وإزالة الجلد فوق المكونات هلام المصفوفة.
- اجمع القابس واشطفه في دورق صغير مع 1x PBS لغسل الدم الزائد (الشكل 2 أ). يمكن أن يحدد لون القابس تقريبا درجة وفرة الدم ومحتوى الأوعية الجديدة (الشكل 3 أ).
8. تضمين مصفوفة هلام المكونات وإعداد القسم
- قم بتغطية زر علبة تضمين الأنسجة بحوالي 0.5 مل من جل تضمين الأنسجة ، ثم ضع سدادة هلام المصفوفة على الفور على جل تضمين الأنسجة في الاتجاه المطلوب كما هو موضح في الشكل 2 ب. بعد ذلك ، قم بتضمين القابس مع جل إضافي لتضمين الأنسجة.
- ضع الكاسيتات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 12 ساعة حتى تتصلب.
- لإعداد المقطع السميك ، أخرج كتلة القابس الصلبة واقطع أقساما بسمك 12 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم التجميد وفقا للتعليمات ، وقم بتركيبها على شرائح المجهر.
- شريحة 5-10 أقسام من كل كتلة القابس.
9. القياس الكمي لتكوين الأوعية (الشكل 3)
- احصل على صور مضان من 5 حقول مستقلة للقسم باستخدام مجهر مضان مقلوب بطول موجي 488 نانومتر تحت تكبير 10x.
- افتح ملف الصورة باستخدام برنامج Image J (https://imagej.en.softonic.com/) وانقر فوق الزر تحليل تكوين الأوعية . ثم ، انقر فوق تحليل تباين المرحلة HUVEC زر ، والتبديل إلى جدول نتائج Stat لجمع المعلومات. قم بقياس جميع الصور الفلورية ال 5 المكتسبة لكل قسم.
- تحليل الطول الإجمالي للأوعية الجديدة من مجموعات مختلفة لتقييم إحصائيا الفرق في تولد الأوعية بين هذه المجموعات.
ملاحظة: يشير إجمالي طول الأجزاء الرئيسية إلى الطول الإجمالي للسفن الجديدة. يطلق على الكاشف الذي يزيد من طول الأوعية الجديدة اسم pro-angiogenic ، في حين أن الكاشف الذي يقلل من طول الأوعية الجديدة هو مضاد للأوعية الوعائية.
10. القياس الكمي لنفاذية الأوعية الدموية (الشكل 4)
- احصل على صور مضان من 5 حقول مستقلة للقسم باستخدام مجهر مضان مقلوب بطول موجي 488 نانومتر تحت تكبير 20x.
- افتح ملف الصورة باستخدام برنامج Image J. انقر فوق الزر Freehand Selection وقم بوضع دائرة حول منطقة التسرب ، ثم انقر فوق قائمة Analyze وحدد خيار القياس للحصول على معلومات المنطقة الخاصة بمنطقة التسرب. استخدم نسبة منطقة التسرب ومنطقة الصورة للإشارة إلى نفاذية الأوعية الدموية.
- تحليل نسبة مساحة التسرب ومساحة الصورة من مجموعات مختلفة لتقييم إحصائيا الفرق في نفاذية الأوعية الدموية بين هذه المجموعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 هو المخطط الانسيابي الذي يوضح كيفية تحضير خليط هلام المصفوفة والخلايا الوعائية ووسط الاستزراع والكاشف. ثم تم حقن الخليط تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران Nu / Nu وتسخينه باستخدام وسادة تسخين لتسريع تجلط الدم لتشكيل سدادة هلامية في النهاية.
الشكل 2 أ هو المخطط الانسيابي للإشارة إلى الأوعية ذات الفلورسنت المسمى ديكستران. تم حقن الفلورسنت المسمى ديكستران عبر الوريد الذيلي والدائرة لمدة 30 دقيقة ، بحيث يمكن أن يدخل الوعاء الوظيفي في سدادة الهلام. بعد ذلك ، تم جمع سدادات الهلام ، المضمنة باستخدام هلام تضمين الأنسجة (تمت الإشارة إلى اتجاه هلام المصفوفة عند تضمينه في الشكل 2 ب). تم تقطيع مقطع سميك 12 ميكرومتر من المقابس (5 شرائح من كل جانب) وتم التقاط صور الفلورسنت للتحليل الكمي لتكوين الأوعية و / أو نفاذية الأوعية الدموية.
الشكل 3 هو تأثير بالميتات الكاشف المضاد لتولد الأوعية وعامل نمو الخلايا الليفية الكاشف المؤيد لتولد الأوعية 1 (FGF1) على تكوين الأوعية في سدادة الهلام. الشكل 3 أ هو ظهور سدادات هلام مع مركبة أو بالميتات أو FGF1. يمكن أن يدخل الدم إلى الوعاء الجديد الوظيفي في سدادة الهلام ، مما يجعل القابس أحمر بدرجات متفاوتة. الشكل 3B هو الصورة الفلورية لسدادات هلام المصفوفة ، حيث تم تصور الأوعية الوظيفية بواسطة dextran-FITC بوزن جزيئي مرتفع. الشكل 3C هو النتيجة الكمية لطول السفينة لمجموعة مختلفة. يمكن أن يقلل بالميتات بشكل كبير من طول الأوعية الجديدة ، في حين أن علاج FGF1 يمكن أن يزيد الطول بشكل واضح.
يقارن الشكل 4 نفاذية الأوعية الدموية في سدادات الهلام مع أو بدون علاج عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). الشكل 4A هو الصورة الفلورية لسدادات هلام المصفوفة ، حيث يتم تصور منطقة التسرب بواسطة dextran-FITC بوزن جزيئي منخفض ويشار إليها بالأسهم. الشكل 4B هو النتيجة الكمية لمنطقة التسرب. كشفت زيادة منطقة التسرب في مجموعة علاج VEGF أن VEGF يمكن أن يزيد من نفاذية الأوعية الدموية.
الشكل 1. مخطط انسيابي يوضح تكوين سدادة هلامية في الفئران. يتم فصل الخلايا الوعائية المستزرعة في ثقافة أحادية الطبقة ، وحبيباتها ، وإعادة تعليقها بوسط الخلية البطانية (ECM) ، وعدها (I-IV). بعد التكوير وإعادة التعليق في خليط هلام المصفوفة (يحتوي على 8.8 حجم هلام مصفوفة ، 1 حجم 10x M199 مكمل ب 10٪ FBS و 0.2 كاشف حجم) ، تم حقن 300 ميكرولتر من خليط الهلام تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران (V-VII) لتشكيل المقابس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مخطط انسيابي يوضح حقن ديكستران-FITC والقياس الكمي لتكوين الأوعية. (أ) تم حقن ديكستران-FITC عن طريق الوريد الذيلي (I). بعد 30 دقيقة ، تم الحصول على قابس جل وتضمينه وتقطيع المقاطع باستخدام ميكروتوم التجميد (II ، III). بعد ذلك ، تم التقاط صور مضان باستخدام المجهر الفلوري (IV) وتم تحليل تكوين الأوعية كميا باستخدام برنامج Image J (V). (ب) رسم تخطيطي لاتجاه سدادة هلام المصفوفة عند تضمينه في شريط تضمين الأنسجة. الاختصارات: OCT = مركب درجة حرارة القطع الأمثل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تقييم تكوين الأوعية باستخدام مقايسة سدادة هلام المصفوفة المعدلة. (أ) ظهور سدادات هلام مصفوفة تمثيلية. (ب) الصورة الفلورية للأوعية الوظيفية في سدادات هلام المصفوفة المشار إليها بواسطة Dextran-FITC. (ج) التحليل الكمي لطول الأوعية الوظيفية في سدادات هلام المصفوفة باستخدام ANOVA. * p < 0.05 مقابل السيارة ؛ P<0.001 مقابل السيارة. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. الاختصارات: FGF1 = عامل نمو الخلايا الليفية 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تقييم نفاذية الأوعية الدموية باستخدام مقايسة سدادة هلام المصفوفة المعدلة. (أ) الصورة الفلورية التمثيلية للأوعية في سدادة هلامية ، تشير الأسهم إلى موقع التسرب. (ب) التحليل الكمي لمنطقة التسرب لتقييم نفاذية الأوعية الدموية باستخدام اختبار t للطالب. ص<0.001. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. الاختصارات: VEGF = عامل نمو بطانة الأوعية الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم طريقة موثوقة ومريحة للتقييم الكمي لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي دون تلطيخ. في هذا البروتوكول ، تم خلط الخلايا الوعائية مع هلام المصفوفة في وجود كواشف مؤيدة لتولد الأوعية أو مضادة لتولد الأوعية ، ثم حقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران Nu / Nu لتشكيل سدادة هلامية (الشكل 1). بعد 7 أيام من تكوين سدادة الهلام ، تم حقن ديكستران-FITC عن طريق الوريد وتعميمه لمدة 30 دقيقة. تم جمع سدادة الجل ودمجها مع هلام تضمين الأنسجة ، وتم تقطيع أقسام 12 ميكرومتر للتصوير الفوتوغرافي (الشكل 2). يمكن أن يشير Dextran-FITC إلى الأوعية الوظيفية دون تلطيخ ، ويمكن استخدام طول الأوعية الجديدة لإجراء تقييم كمي لوظيفة الكواشف المؤيدة لتولد الأوعية أو المضادة لتولد الأوعية. في المثال المقدم في هذا البروتوكول ، قلل علاج بالميتات من طول الأوعية الجديدة ، بينما زاد FGF1 من طول الأوعية الجديدة (الشكل 3) ، مما يشير إلى أن البالميتات مضاد لتولد الأوعية ، في حين أن FGF1 مؤيد لتولد الأوعية. إلى جانب ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول في تقييم نفاذية الأوعية الدموية (الشكل 4).
يجب توخي الحذر عند اختيار الفئران المتلقية ، والتعامل مع هلام المصفوفة وحقنه ، وجمع سدادة الهلام ، واكتشاف طول الأوعية. يوصى باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتي تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع ، على الرغم من أن الفئران C57BL / 6 قابلة للتطبيق أيضا. بالنظر إلى التباين في القابس ، يوصى باستخدام 3-5 مقابس في كل مجموعة. يجب أن يكون عدد الخلايا الوعائية متساويا بين المجموعات المختلفة. يجب التعامل مع Matrix gel بعناية وفقا للتعليمات ويجب عدم استخدامه إذا كان صلبا أو يحتوي على جسيمات أو فقاعات عديدة. في خطوة تحضير هلام المصفوفة ، يجب ألا يقل التركيز النهائي لهلام المصفوفة عن 80٪ ، ولا يسمح بالدوامة حيث قد تتشكل الفقاعات. وتجدر الإشارة إلى أن شكل سدادة الهلام قد يؤثر على قابلية استنساخ النتائج ، لذلك تم استخدام وسادة التدفئة لتسريع تصلب سدادة هلام المصفوفة. يمكن أيضا استخدام حاضنة 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء تضمين سدادة الهلام وإعداد القسم ، يجب حماية المقابس والأقسام من الضوء الساطع ، ويجب التقاط الصور تحت المجهر الفلوري في أسرع وقت ممكن.
من بين مختلف مقايسات تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي ، يعد مقايسة سدادة هلام المصفوفة أحد أكثر الطرق استخداما لأنه متعدد الاستخدامات وأقل تكلفة وسهل الأداء11. ومع ذلك ، فإن عملية التلوين في مقايسة سدادة هلام المصفوفة العادية عرضة للخطأ. القابس هش ويحتوي على نسبة عالية من الماء. قد تؤدي خطوات الجفاف والتثبيت المضمنة في عملية التلوين إلى تشويه سدادة الهلام ، وتؤثر بشكل أكبر على تقييم طول الأوعية. إلى جانب ذلك ، قد تكون الخلايا الوعائية المتناثرة في السدادة ملطخة ومعترف بها كأوعية وظيفية في مقايسة سدادة هلام المصفوفة العادية. واحدة من أهم مزايا مقايسة سدادة هلام المصفوفة المعدلة هي أنه يمكن تصور الأوعية الوظيفية دون تلطيخ. تم استخدام ديكستران المسمى FITC للإشارة إلى الأوعية ، ويمكن الإشارة فقط إلى الأوعية الوظيفية التي لديها تدفق الدم ، مما يساهم في راحة وموثوقية هذا الفحص.
إلى جانب طول الأوعية الجديدة ، تؤثر النفاذية أيضا على وظيفة السفن الجديدة20. يمكن أن يمر ديكستران المسمى بالفلورسنت ذو الوزن الجزيئي المنخفض (~ 4400 دا) عبر الفجوة في الأوعية ويمكن استخدامه للإشارة إلى نفاذية الأوعية الجديدة. إذا لزم الأمر ، يمكن للباحثين تقييم كل من تكوين الأوعية ونفاذية الأوعية الدموية في نفس المكونات الهلامية باستخدام كل من ديكستران المسمى بالفلورسنت مع انخفاض الوزن الجزيئي وذلك مع الوزن الجزيئي العالي21.
يمكن أن يتأثر تكوين الأوعية بالبيئة في الجسم الحي 22 ، مثل مرض السكري13،14،19 ، إلخ. يصعب إعادة إنتاج هذه البيئة في الجسم الحي في هذه النماذج في المختبر . ومع ذلك ، في هذا البروتوكول المعدل ، يمكن إعادة إنتاج البيئة في الجسم الحي بسهولة عن طريق اختيار الفئران المتلقية المناسبة. إلى جانب ذلك ، يؤثر التفاعل بين خلايا الأوعية الدموية المختلفة أيضا على عملية تكوين الأوعية. يمكن إضافة أنواع مختلفة من الخلايا الوعائية ، بما في ذلك الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء والخلايا المحيطة ، لتشكيل أوعية جديدة في القابس في هذا البروتوكول للتحقق من مساهمة الخلايا الوعائية المختلفة في تكوين الأوعية.
ومع ذلك ، هناك أيضا بعض القيود على هذه الطريقة. يمكن أن يتأثر تكوين الأوعية الجديدة بشكل سدادة هلام. علاوة على ذلك ، فإن الأوعية الجديدة التي تشكلت في سدادة الهلام ليست متساوية. هناك أوعية وظيفية على حافة سدادة الهلام أكثر من تلك الموجودة في المركز (الشكل 2 أ). وبالتالي ، قد تتأثر النتائج بكفاءة المؤدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (LY22H020005) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81873466).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
