Summary
De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.
Abstract
Er zijn verschillende modellen ontwikkeld om angiogenese in vivo te onderzoeken. De meeste van deze modellen zijn echter complex en duur, vereisen gespecialiseerde apparatuur of zijn moeilijk uit te voeren voor latere kwantitatieve analyse. Hier presenteren we een gemodificeerde matrix gelplug-assay om angiogenese in vivo te evalueren. In dit protocol werden vasculaire cellen gemengd met matrixgel in de aan- of afwezigheid van pro-angiogene of anti-angiogene reagentia, en vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van ontvangende muizen. Na 7 dagen wordt fosfaatbufferzoutoplossing met dextran-FITC via de staartader geïnjecteerd en gedurende 30 minuten in vaten gecirculeerd. Matrixgelpluggen worden verzameld en ingebed met weefselinbeddingsgel, waarna secties van 12 μm worden gesneden voor fluorescentiedetectie zonder kleuring. In deze test kan dextran-FITC met een hoog molecuulgewicht (~150.000 Da) worden gebruikt om functionele vaten aan te duiden voor het detecteren van hun lengte, terwijl dextran-FITC met een laag molecuulgewicht (~4.400 Da) kan worden gebruikt om de permeabiliteit van neovaten aan te geven. Concluderend kan dit protocol een betrouwbare en handige methode bieden voor de kwantitatieve studie van angiogenese in vivo.
Introduction
Angiogenese, het proces van vorming van neovaten uit reeds bestaande vaten, speelt een cruciale rol in veel fysiologische en pathologische processen, zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing, atherosclerose, tumorontwikkeling, enz.1,2,3,4,5. Dit dynamische proces omvat verschillende stappen, waaronder de afbraak van de matrix, vasculaire celproliferatie, migratie en zelforganisatie om buisvormige structuren te vormen en de stabilisatie van de neovaten6. Het is aangetoond dat het bevorderen van angiogenese van cruciaal belang is bij de behandeling van myocardinfarct, beroerte en andere soorten ischemische ziekten7, terwijl het remmen van angiogenese wordt beschouwd als een veelbelovende strategie bij de behandeling van kankers8 en reumatoïde aandoeningen9. Angiogenese wordt beschouwd als een organiserend principe voor de ontdekking van geneesmiddelen10. De constructie van een betrouwbare en handige methode om de omvang van angiogenese te beoordelen, is dus van cruciaal belang voor mechanisch onderzoek of het ontdekken van geneesmiddelen bij angiogenese-afhankelijke ziekten.
Er zijn verschillende in vitro en in vivo modellen ontwikkeld om angiogenesete evalueren 11. Hiervan kunnen tweedimensionale (2D) modellen, zoals matrix gelbuisvormingstest12, geen functionele buisvormige structuren vormen. De diermodellen, zoals het ischemiemodel13,14 van de achterpoten, kunnen het angiogeneseproces reproduceren, maar zijn complex en vereisen een laserspikkelbeeldvormingssysteem. 3D-modellen van vasculaire morfogenese, zoals matrixgelplug-assay, bieden een eenvoudig platform dat het proces van angiogenese in vivo15 kan nabootsen, maar de detectie van angiogenese vereist immunohistochemie of immunofluorescentiekleuring 16,17,18, die variabel en slecht gevisualiseerd zijn.
Hier beschrijven we een protocol voor een gemodificeerde matrix gel plug assay waarbij vasculaire cellen werden gemengd met matrix gel en subcutaan geïnjecteerd in de rug van muizen om een plug te vormen. In de plug moeten vasculaire cellen de matrix afbreken, zich vermenigvuldigen, migreren en zichzelf organiseren om uiteindelijk functionele bloedvaten te vormen met bloedstroom in de interne omgeving. Daarna wordt fluorescerend gelabeld dextran geïnjecteerd via de staartader, om door de plug te stromen, en het label wordt gevisualiseerd om neovaten aan te geven. De inhoud van angiogenese kan kwantitatief worden geëvalueerd aan de hand van de lengte van de bloedvaten. Deze methode kan functionele vaten vormen die niet kunnen worden geproduceerd in 2D-angiogenesemodellen12, en vereist geen complex kleuringsproces zoals in gewone matrixgelplugtest11. Het vereist ook geen dure specifieke instrumenten zoals laserspikkelbloedstroombeeldvormingssysteem in ischemiemodel 13,14,19 van de achterpoten. Deze methode is veelzijdig, goedkoop, kwantificeerbaar en gemakkelijk uit te voeren, en kan worden gebruikt om het pro- of anti-angiogene vermogen van geneesmiddelen te bepalen of kan worden gebruikt in mechanisch onderzoek dat betrokken is bij angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij proefdieren betrokkenwaren, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 juli 2021). Alle reagentia en verbruiksartikelen staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Bereiding van kweekmedium
- 10x M199 kweekmedium: Los M199-poeder op tot een concentratie van 10x met 90 ml gedeïoniseerd water en voeg 10 ml foetaal runderserum (FBS) toe en passeer vervolgens door een filter van 0,22 μm. Bewaar het medium maximaal 2 maanden bij 4 °C.
- Volledig endotheelkweekmedium: Voeg 50 ml FBS, 5 ml penicilline/streptomycine en 5 ml endotheelcelgroeisupplement toe aan 460 ml endotheelcelmedium (ECM). Bewaar het medium maximaal 1 maand bij 4 °C.
2. Voorbereiding van vasculaire cellen
- Kweek 1 x 105 vasculaire cellen (primair gekweekte endotheelvoorlopercellen14, endotheelcellen of endotheelcellijnen) met 8 ml volledig endotheelkweekmedium in weefselkweekschaal van 100 mm bij 37 °C en 5% CO2 tot 70% confluentie.
- Verwijder het kweekmedium en spoel de schaal 2x met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om losse cellen en vuil te verwijderen. Verwijder PBS en voeg 3 ml 0,25% trypsine met 2,21 mM EDTA toe en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 °C.
- Neutraliseer de trypsine met 7 ml volledig endotheelkweekmedium en spoel de cellen voorzichtig van het kweekschaaltje. Bevestig de celloslating onder een lichtmicroscoop (40x vergroting).
- Vang de celsuspensie op in een buisje van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g . Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen met 5 ml volledig endotheelkweekmedium.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en verplaats de suspensie met 2 x 106 cellen naar een steriele buis van 1,5 ml. Elke plug bevat 1,5 x 106 cellen, extra 25% cellen worden gebruikt in geval van afval. Elke groep bevat minimaal 3 stekkers.
OPMERKING: Na proeven bleek dat 1,5 x 106 cellen in 300 μL matrixgel leidden tot de juiste ontwikkeling van angiogenese en daarom werd gekozen voor experimenten. - Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten tot de pelletcellen en verwijder vervolgens het supernatant.
3. Voorbereiding van matrixgel
- Koel steriele buisjes van 1,5 ml met celpellets voor in een waterbad van 4 °C. Koel 30 g insulinespuiten van 1 ml voor in een koelkast van 4 °C.
- Matrixgel volledig ontdooien in een waterbad van 4 °C. Niet mengen of vortexen. 10x M199 voorkoelen en reagens/geneesmiddel-of-interest testen in een waterbad van 4 °C.
- Meng voorgekoelde matrixgel met 10x M199 met 10% FBS en het te testen reagens in een volumeverhouding van 8,8:1:0,2 om een matrixgel en M199-mengsel te krijgen dat 1% FBS en het reagens bevat.
- Resuspendeer de cellen met 400 μL van het matrixgelmengsel, meng voorzichtig om belletjes te voorkomen. Houd de buis op ijs totdat de muizen klaar zijn voor injectie. Bewaar het matrixgelmengsel de hele tijd op ijs om stolling te voorkomen.
OPMERKING: Hier werd 300 μL matrixgelmengsel met 1,5 x 106 cellen gebruikt om een gelplug te vormen. Bereid 25% extra gel volgens 25% extra cellen in stap 2.
4. Voorbereiding van de muis
- Verdoof de 6-8 weken oude mannelijke Nu/Nu-muis (18-25 g) in de kamer van het anesthesieapparaat voor dieren met isofluraan (3% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l/min). Na succesvolle anesthesie, bevestigd door de afwezigheid van een oprichtreflex en een teenknijpreflex, verplaatst u de muis uit de kamer, verplaatst u de muis uit de kamer en plaatst u een anesthesiemasker op de muis en verandert u de concentratie isofluraan in 1,5% in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l/min.
NOTITIE: Bied het dier thermische ondersteuning met behulp van een verwarmingskussen tijdens de procedure. - Gebruik dierenartszalf op de ogen om uitdroging te voorkomen. Plak de ledematen van de muizen op het operatiebord in buikligging.
5. Injectie van het matrixgelmengsel
- Doe 300 μL van het matrixgelmengsel in een insulinespuit van 1 ml met een naald van 30 G. Vermijd luchtbelvorming. Laad de matrixgel snel (binnen 2 minuten) om stollen gedurende deze tijd te voorkomen. Plaats de insulinespuit gevuld met matrixgel onmiddellijk op ijs.
- Reinig de huid op de rug van muizen met 75% alcoholpads. Injecteer subcutaan 300 μL matrixgelmengsel in één kant van de rug van muizen.
- Verwijder de naald voorzichtig van de injectieplaats om lekkage van het matrixgelmengsel te voorkomen. Controleer of er een kleine bult op de injectieplaats is (Figuur 1).
- Plaats de muis 2 minuten op het verwarmingskussen om het matrixgelmengsel te laten stollen en een plug te vormen.
- Herhaal stap 5.2. tot en met 5.4. om een plug aan de andere kant van de achterkant van de muis te maken. Markeer de randen van de bulten met een markeerstift.
- Observeer de muis totdat deze weer voldoende bij bewustzijn is om sternale lighouding te behouden. Plaats de muis in een aparte kooi totdat deze volledig is hersteld. Huisvest de muizen in proefdierlaboratorium van SPF-klasse bij 22 ± 2 °C met een licht/donkercyclus van 12 uur gedurende 7 dagen.
6. Dextran-FITC-injectie via de staartader
- Na 7 dagen matrixgelinjectie 0,5 mg dextran-FITC resuspenderen met 500 μL dubbel gedestilleerd water (ddH2O) en vervolgens krachtig vortex om de dextran-FITC-oplossing te verkrijgen in de uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL.
OPMERKING: Gebruik dextran-FITC met een molecuulgewicht van ~150 kDa voor angiogenese-test en gebruik dextran-FITC met een molecuulgewicht van ~4 kDa voor vasculaire permeabiliteitstest. - Doe 50 μl dextran-FITC-oplossing in de 29G-spuiten.
- Bevestig de muis op het injectie-instrument voor de staartader. Reinig de staart met een watje met 75% alcohol en injecteer voorzichtig 50 μL dextran-FITC door de staartader.
- Druk de injectieplaats gedurende 1 minuut samen met een wattenstaafje om het bloeden te stelpen en plaats de muizen vervolgens 30 minuten terug in de kooi.
- Herhaal stap 6.3. en 6.4. totdat alle muizen een dextran-FITC-injectie hebben gekregen.
7. Matrix gel plug collectie
- Injecteer intraperitoneaal 1% pentobarbitalnatrium in PBS (200 mg/kg lichaamsgewicht) en euthanaseer de muizen met een door de IACUC goedgekeurde procedure.
- Knip de huid langs de gemarkeerde rand van de plug af met een chirurgische schaar en verwijder de huid boven de matrixgelplug.
- Vang de plug op en spoel deze af in een klein bekerglas met 1x PBS om overtollig bloed weg te spoelen (Figuur 2A). De kleur van de plug kan ruwweg de mate van bloedovervloed en het gehalte aan neovaten afbakenen (Figuur 3A).
8. Inbedding van matrixgelplug en sectievoorbereiding
- Bedek de knop van de weefselinbeddingscassette met ongeveer 0.5 ml weefselinbeddingsgel en plaats vervolgens onmiddellijk de matrixgelplug op de weefselinbeddingsgel in de gewenste richting zoals weergegeven in afbeelding 2B. Sluit vervolgens de plug in met extra weefselinbeddingsgel.
- Zet de cassettes 12 uur in een vriezer van -80 °C om te stollen.
- Voor de voorbereiding van dikke secties verwijdert u het gestolde plugblok en snijdt u 12 μm dikke secties met behulp van de vriesmicrotoom volgens de instructie en monteert u deze op microscoopglaasjes.
- Snijd 5-10 secties van elk plugblok.
9. Kwantificering van angiogenese (figuur 3)
- Verkrijg fluorescentiebeelden van 5 onafhankelijke velden van de sectie met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een golflengte van 488 nm bij een vergroting van 10x.
- Open het afbeeldingsbestand met Image J-software (https://imagej.en.softonic.com/) en klik op de knop Angiogenesis Analyze . Klik vervolgens op HUVEC Phase Contrast analyseren knop en schakel over naar Tabel met statresultaten om informatie te verzamelen. Meet alle 5 verkregen fluorescentiebeelden voor elke sectie.
- Analyseer de totale lengte van neo-vaten uit verschillende groepen om het verschil in angiogenese tussen deze groepen statistisch te evalueren.
OPMERKING: De totale lengte van de hoofdsegmenten geeft de totale lengte van neo-schepen aan. Het reagens dat de lengte van neovaten vergroot, wordt pro-angiogeen genoemd, terwijl het reagens dat de lengte van neovaten verkleint, anti-angiogeen is.
10. Kwantificering van de vasculaire permeabiliteit (figuur 4)
- Verkrijg fluorescentiebeelden van 5 onafhankelijke velden van de sectie met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een golflengte van 488 nm onder een vergroting van 20x.
- Open het afbeeldingsbestand met Image J-software. Klik op de knop Selectie uit de vrije hand en omcirkel het lekgebied, klik vervolgens op het menu Analyseren en selecteer de optie Meten om de gebiedsinformatie van het lekgebied te krijgen. Gebruik de verhouding tussen het lekgebied en het beeldgebied om de vasculaire permeabiliteit aan te geven.
- Analyseer de verhouding tussen het lekgebied en het gebied van het beeld van verschillende groepen om het verschil in vasculaire permeabiliteit tussen deze groepen statistisch te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 is het stroomschema dat laat zien hoe het mengsel van matrixgel, vasculaire cellen, kweekmedium en reagens moet worden bereid. Het mengsel werd vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van Nu/Nu-muizen en verwarmd met behulp van een verwarmingskussen om de coagulatie te versnellen om uiteindelijk een gelplug te vormen.
Figuur 2A is het stroomschema om vaten met fluorescerend gelabeld dextran aan te geven. Fluorescerend gelabeld dextran werd gedurende 30 minuten via de staartader en cirkel geïnjecteerd, zodat het het functionele vat in de gelplug kan binnendringen. Daarna werden de gelpluggen verzameld, ingebed met behulp van weefselinbeddingsgel (de oriëntatie van matrixgel wanneer deze was ingebed, werd aangegeven in figuur 2B). Een 12 μm dik gedeelte werd uit de pluggen gesneden (5 plakjes aan elke kant) en er werden fluorescerende foto's gemaakt voor kwantitatieve analyse van angiogenese en/of vasculaire permeabiliteit.
Figuur 3 is de invloed van anti-angiogeen reagenspalmitaat en pro-angiogeen reagens fibroblastgroeifactor 1 (FGF1) op angiogenese in de gelplug. Figuur 3A is het uiterlijk van gelpluggen met voertuig, palmitaat of FGF1. Bloed kan het functionele neo-vat in de gelplug binnendringen, waardoor de plug in verschillende mate rood wordt. Figuur 3B is het fluorescerende beeld van matrixgelpluggen, waarin de functionele vaten werden gevisualiseerd door dextran-FITC met een hoog molecuulgewicht. Figuur 3C is het kwantitatieve resultaat van de lengte van de schepen van de verschillende groepen. Palmitaat kan de lengte van neovaten aanzienlijk verkorten, terwijl FGF1-behandeling uiteraard de lengte kan vergroten.
Figuur 4 vergelijkt de vasculaire permeabiliteit in gelpluggen met of zonder vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) behandeling. Figuur 4A is het fluorescerende beeld van matrixgelpluggen, waarin het lekgebied wordt gevisualiseerd door dextran-FITC met een laag molecuulgewicht en wordt aangegeven met pijlen. Figuur 4B is het kwantitatieve resultaat van het lekgebied. Het verhoogde lekgebied in de VEGF-behandelingsgroep onthulde dat VEGF de vasculaire permeabiliteit kan verhogen.
Figuur 1. Stroomdiagram met de vorming van een gelplug bij muizen. Vasculaire cellen die in monolaagcultuur worden gekweekt, worden gedissocieerd, gepelleteerd, geresuspendeerd met endotheelcelmedium (ECM) en geteld (I-IV). Na pelletering en resuspensie in matrixgelmengsel (met 8,8 volume matrixgel, 1 volume 10x M199 aangevuld met 10% FBS en 0,2 volumereagens), werd 300 μL gelmengsel subcutaan in de rug van de muizen (V-VII) geïnjecteerd om pluggen te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Stroomdiagram met dextran-FITC-injectie en kwantificering van angiogenese. (A) Dextran-FITC werd geïnjecteerd via de staartader (I). Na 30 minuten werd de gelplug verkregen, ingebed en werden secties gesneden met behulp van bevriezingsmicrotoom (II, III). Daarna werden fluorescentiebeelden gemaakt met behulp van een fluorescentiemicroscoop (IV) en werd angiogenese kwantitatief geanalyseerd met behulp van Image J-software (V). (B) Het diagram van de oriëntatie van de matrixgelplug wanneer deze is ingebed in een weefselinbeddingscassette. Afkortingen: OCT = optimale snijtemperatuur compound. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Evaluatie van angiogenese met behulp van gemodificeerde matrixgelplug-assay. (A) Uiterlijk van representatieve matrixgelpluggen. (B) Het fluorescerende beeld van functionele vaten in matrixgelpluggen aangegeven door Dextran-FITC. (C) De kwantitatieve analyse van de lengte van functionele vaten in matrixgelpluggen met behulp van eenrichtings-ANOVA. *p<0,05 t.o.v. voertuig; p<0,001 versus voertuig. De schaalbalk is 100 μm. Afkortingen: FGF1 = Fibroblast groeifactor 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Evaluatie van vasculaire permeabiliteit met behulp van gemodificeerde matrixgelplug-assay. (A) Het representatieve fluorescentiebeeld van vaten in gelplug, de pijlen geven de lekkageplaats aan. (B) De kwantitatieve analyse van het lekgebied om de vasculaire permeabiliteit te evalueren met behulp van de t-toets van de student. blz<0,001. De schaalbalk is 100 μm. Afkortingen: VEGF = vasculaire endotheliale groeifactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een betrouwbare en handige methode voor de kwantitatieve evaluatie van angiogenese in vivo zonder kleuring. In dit protocol werden vasculaire cellen gemengd met matrixgel in aanwezigheid van pro-angiogene of anti-angiogene reagentia, en vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van Nu/Nu-muizen om een gelplug te vormen (Figuur 1). Na 7 dagen vorming van gelpluggen werd dextran-FITC intraveneus geïnjecteerd en gedurende 30 minuten gecirculeerd. De gelplug werd verzameld en ingebed met weefselinbeddingsgel, en secties van 12 μm werden gesneden voor fotografie (Figuur 2). Dextran-FITC kan functionele vaten aangeven zonder kleuring, en de lengte van neovaten kan worden gebruikt om de pro-angiogene of anti-angiogene functie van reagentia kwantitatief te evalueren. In het voorbeeld dat in dit protocol wordt gepresenteerd, verminderde de behandeling met palmitaat de lengte van neo-vaten, terwijl FGF1 de lengte van neovaten vergrootte (Figuur 3), wat aangaf dat palmitaat anti-angiogeen is, terwijl FGF1 pro-angiogeen is. Daarnaast kan dit protocol ook worden gebruikt bij de evaluatie van de vasculaire permeabiliteit (Figuur 4).
Voorzichtigheid is geboden bij de selectie van de ontvangende muizen, het hanteren en injecteren van de matrixgel, het verzamelen van de gelplug en het detecteren van de lengte van de bloedvaten. Immunodeficiënte muizen van 6-8 weken oud worden aanbevolen, hoewel C57BL/6-muizen ook werkbaar zijn. Gezien de variabiliteit in de stekker, worden 3-5 stekkers in elke groep aanbevolen. Het aantal vasculaire cellen moet gelijk zijn tussen verschillende groepen. Matrixgel moet zorgvuldig worden behandeld volgens de instructies en mag niet worden gebruikt als het gestold is of deeltjes of veel belletjes bevat. In de voorbereidingsstap van de matrixgel mag de uiteindelijke concentratie matrixgel niet lager zijn dan 80% en is vortex niet toegestaan omdat er bellen kunnen worden gevormd. Opgemerkt moet worden dat de vorm van de gelplug de reproduceerbaarheid van de resultaten kan beïnvloeden, dus werd een verwarmingskussen gebruikt om de stolling van de matrixgelplug te versnellen. Er kan ook gebruik worden gemaakt van een 37 °C broedmachine voor dieren. Daarnaast moeten tijdens het inbedden van gelpluggen en de voorbereiding van secties pluggen en secties worden beschermd tegen fel licht en moeten foto's zo snel mogelijk onder een fluorescentiemicroscoop worden gemaakt.
Van de verschillende in vivo angiogenese-assays is de matrix-gelplug-assay een van de meest gebruikte methoden omdat deze veelzijdig, goedkoper en gemakkelijk uit te voerenis11. Het kleuringsproces in de gewone matrix-gelplug-assay is echter foutgevoelig. De plug is kwetsbaar en heeft een hoog watergehalte. De uitdrogings- en fixatiestappen die in het kleuringsproces zijn opgenomen, kunnen de gelplug vervormen en de evaluatie van de lengte van de bloedvaten verder beïnvloeden. Daarnaast kunnen de verspreide vasculaire cellen in de plug worden gekleurd en herkend als functionele vaten in een gewone matrix-gelplugtest. Een van de belangrijkste voordelen van deze gemodificeerde matrix gelplug-assay is dat de functionele vaten kunnen worden gevisualiseerd zonder kleuring. FITC-gelabeld dextran werd gebruikt om bloedvaten aan te duiden, en alleen functionele bloedvaten met bloedstroom kunnen worden aangegeven, wat bijdraagt aan het gemak en de betrouwbaarheid van deze test.
Naast de lengte van neo-vaten heeft ook de permeabiliteit invloed op de functie van neovaten20. Fluorescerend gelabeld dextran met een laag molecuulgewicht (~4.400 Da) kan door de opening in bloedvaten gaan en kan worden gebruikt om de permeabiliteit van neo-vaten aan te geven. Indien nodig kunnen onderzoekers zowel angiogenese als vasculaire permeabiliteit in dezelfde gelplug evalueren door zowel fluorescerend gelabeld dextran met een laag molecuulgewicht als dat met een hoog molecuulgewicht te gebruiken.
Angiogenese kan worden beïnvloed door de in vivo omgeving22, zoals diabetes 13,14,19, enz. Deze in vivo omgeving is moeilijk te reproduceren in deze in vitro modellen. In dit aangepaste protocol kan de in vivo omgeving echter gemakkelijk worden gereproduceerd door de juiste ontvangende muizen te kiezen. Daarnaast heeft de interactie tussen verschillende vasculaire cellen ook invloed op het proces van angiogenese. Verschillende soorten vasculaire cellen, waaronder endotheelcellen, gladde spiercellen en pericyten, kunnen worden toegevoegd om neovaten te vormen in de plug in dit protocol om de bijdrage van verschillende vasculaire cellen aan angiogenese te onderzoeken.
Er zijn echter ook enkele beperkingen voor deze methode. De vorming van neovaten kan worden beïnvloed door de vorm van de gelplug. Bovendien zijn de neovaten die in de gelplug worden gevormd niet gelijkmatig. Er zijn meer functionele vaten aan de rand van de gelplug dan die in het midden (Figuur 2A). De resultaten kunnen dus worden beïnvloed door de vaardigheid van de uitvoerder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (LY22H020005) en de National Natural Science Foundation of China (81873466).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
