Summary
Metoden præsenteret her kan evaluere effekten af reagenser på angiogenese eller vaskulær permeabilitet in vivo uden farvning. Metoden bruger dextran-FITC-injektion via halevenen til at visualisere neo-kar eller vaskulær lækage.
Abstract
Flere modeller er blevet udviklet til at undersøge angiogenese in vivo. Imidlertid er de fleste af disse modeller komplekse og dyre, kræver specialudstyr eller er svære at udføre til efterfølgende kvantitativ analyse. Her præsenterer vi et modificeret matrixgelpropassay for at evaluere angiogenese in vivo. I denne protokol blev vaskulære celler blandet med matrixgel i nærvær eller fravær af proangiogene eller antiangiogene reagenser og derefter subkutant injiceret i ryggen af modtagermus. Efter 7 dage injiceres fosfatbuffersaltvand indeholdende dextran-FITC via halevenen og cirkuleres i beholdere i 30 minutter. Matrixgelpropper opsamles og indlejres med vævsindlejringsgel, derefter skæres 12 μm sektioner til fluorescensdetektion uden farvning. I dette assay kan dextran-FITC med høj molekylvægt (~ 150.000 Da) bruges til at indikere funktionelle beholdere til påvisning af deres længde, mens dextran-FITC med lav molekylvægt (~ 4.400 Da) kan bruges til at indikere permeabiliteten af neo-kar. Afslutningsvis kan denne protokol tilvejebringe en pålidelig og bekvem metode til kvantitativ undersøgelse af angiogenese in vivo.
Introduction
Angiogenese, processen med dannelse af neo-kar fra allerede eksisterende kar, spiller en kritisk rolle i mange fysiologiske og patologiske processer, såsom embryonal udvikling, sårheling, aterosklerose, tumorudvikling osv.1,2,3,4,5. Denne dynamiske proces involverer flere trin, herunder nedbrydning af matrixen, vaskulær celleproliferation, migration og selvorganisering til dannelse af rørformede strukturer og stabilisering af neo-karrene6. Fremme af angiogenese har vist sig at være kritisk i behandlingen af myokardieinfarkt, slagtilfælde og andre former for iskæmiske sygdomme7, mens hæmning af angiogenese er blevet betragtet som en lovende strategi i behandlingen af kræft8 og reumatoid sygdom9. Angiogenese er blevet betragtet som et organiserende princip for lægemiddelopdagelse10. Således er konstruktionen af en pålidelig og bekvem metode til vurdering af omfanget af angiogenese kritisk for mekanisk forskning eller lægemiddelopdagelse i angiogeneseafhængige sygdomme.
Flere in vitro og in vivo modeller er blevet udviklet til evaluering af angiogenese11. Blandt disse kan todimensionelle (2-D) modeller, som matrixgelrørdannelsesassay12, ikke danne funktionelle rørformede strukturer. Dyremodellerne, såsom iskæmi i bagbenene model13,14, kan reproducere angiogeneseprocessen, men er komplekse og kræver et laserspeckle blodgennemstrømningsbilleddannelsessystem. 3D-modeller af vaskulær morfogenese, som matrixgelstikassay, giver en simpel platform, der kan efterligne processen med angiogenese in vivo15, men påvisning af angiogenese kræver immunhistokemi eller immunofluorescensfarvning 16,17,18, som er variable og dårligt visualiserede.
Her beskriver vi en protokol for et modificeret matrixgelstikassay, hvor vaskulære celler blev blandet med matrixgel og subkutant injiceret i bagsiden af mus for at danne et stik. I stikket skal vaskulære celler nedbryde matrixen, proliferere, migrere og selvorganisere for endelig at danne funktionelle kar med blodgennemstrømning i det indre miljø. Derefter injiceres fluorescerende mærket dextran via halevenen for at strømme gennem stikket, og etiketten visualiseres for at indikere neo-fartøjer. Indholdet af angiogenese kan kvantitativt evalueres af længden af karrene. Denne metode kan danne funktionelle kar, der ikke kan produceres i 2-D angiogenese modeller12, og behøver ikke kompleks pletproces som i almindelig matrix gel plug assay11. Det kræver heller ikke dyre specifikke instrumenter som laser speckle blodgennemstrømning billeddannelse system i bagben iskæmi model 13,14,19. Denne metode er alsidig, billig, kvantificerbar og nem at udføre og kan bruges til at bestemme lægemidlers pro- eller antiangiogene evne eller anvendes i mekanisk forskning involveret i angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alleprocedurer, der involverer dyreforsøgspersoner, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19. juli 2021). Alle reagenser og forbrugsstoffer er angivet i materialetabellen.
1. Tilberedning af kulturmedium
- 10x M199 dyrkningsmedium: Opløs M199 pulver til 10x koncentration med 90 ml deioniseret vand og tilsæt 10 ml føtalt bovin serum (FBS), og passér derefter gennem et 0,22 μm filter. Opbevar mediet ved 4 °C i op til 2 måneder.
- Komplet endotelkulturmedium: Tilsæt 50 ml FBS, 5 ml penicillin / streptomycin og 5 ml endotelcellevæksttilskud til 460 ml endotelcellemedium (ECM). Opbevar mediet ved 4 °C i op til 1 måned.
2. Vaskulær celleforberedelse
- Dyrkning 1 x 105 vaskulære celler (primære dyrkede endotelstamceller14, endotelceller eller endotelcellelinjer) med 8 ml komplet endotelkulturmedium i 100 mm vævskulturskål ved 37 °C og 5% CO2 til 70% sammenløb.
- Fjern dyrkningsmediet og skyl skålen 2x med 1x fosfatbufret saltvand (PBS) for at fjerne ikke-bundne celler og snavs. PBS fjernes og tilsættes 3 ml 0,25% trypsin indeholdende 2,21 mM EDTA, og inkuberes ved 37 °C i 1 min.
- Neutraliser trypsin med 7 ml komplet endotelkulturmedium, og skyl forsigtigt celler af kulturskålen. Bekræft cellefrigørelse under et lysmikroskop (40x forstørrelse).
- Opsaml cellesuspension i et 15 ml glas og centrifuger ved 400 x g i 10 minutter. Supernatanten fjernes og resuspenderes med 5 ml komplet endoteldyrkningsmedium.
- Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer og flyt suspension indeholdende 2 x 106 celler til et sterilt 1,5 ml rør. Hvert stik indeholder 1,5 x 106 celler, yderligere 25% celler anvendes i tilfælde af affald. Hver gruppe indeholder mindst 3 stik.
BEMÆRK: Efter forsøg blev det konstateret, at 1,5 x 106 celler i 300 μL matrixgel førte til korrekt udvikling af angiogenese og derfor blev valgt til forsøg. - Centrifugercellesuspension ved 400 x g i 5 minutter til pelletceller, og derefter fjernes supernatanten.
3. Matrix gel forberedelse
- Forafkøl sterile 1,5 ml rør indeholdende cellepellet i et 4 °C vandbad. Forafkøl 30G 1 ml insulinsprøjter i et 4 °C køleskab.
- Optø matrixgelen fuldstændigt i et 4 °C vandbad. Bland ikke eller hvirvel. Forafkøles 10x M199 og testreagens/lægemiddel af interesse i et 4 °C vandbad.
- Bland forkølet matrixgel med 10x M199 indeholdende 10% FBS og reagenset, der skal testes ved et volumenforhold på 8,8: 1: 0,2 for at få en matrixgel og M199-blanding indeholdende 1% FBS og reagenset.
- Resuspender celler med 400 μL af matrixgelblandingen, bland forsigtigt for at undgå dannelse af bobler. Hold røret på is, indtil musene er klar til injektion. Hold matrixgelblandingen på is hele tiden for at undgå koagulation.
BEMÆRK: Her blev 300 μL matrixgelblanding indeholdende 1,5 x 106 celler brugt til at danne gelprop. Forbered 25% ekstra gel i henhold til 25% ekstra celler i trin 2.
4. Forberedelse af mus
- Bedøv 6-8 uger gamle Nu/Nu-mus (18-25 g) i kammeret i dyrebedøvelsesapparatet med isofluran (3 % isofluran i 100 % ilt ved en strømningshastighed på 1 l/min). Efter vellykket bedøvelse, bekræftet af fraværet af oprettende refleks og tåklemmerefleks, flyttes musen ud af kammeret, musen flyttes ud af kammeret og sættes en anæstesimaske på musen og koncentrationen af isofluran ændres til 1,5% i 100% ilt ved en strømningshastighed på 1 l / min.
BEMÆRK: Sørg for termisk støtte til dyret ved hjælp af en varmepude under hele proceduren. - Brug dyrlægesalve på øjnene for at forhindre tørhed. Tape musenes lemmer på operationsbrættet i den udsatte position.
5. Injektion af matrixgelblanding
- Læg 300 μL af matrixgelblandingen i en 1 ml insulinsprøjte med en 30G kanyle. Undgå bobledannelse. Læg hurtigt matrixgelen (inden for 2 min) for at undgå størkning i løbet af denne tid. Anbring straks insulinsprøjten fyldt med matrixgel på is.
- Rens huden på bagsiden af mus med 75% alkoholpuder. Subkutant injiceres 300 μL matrixgelblanding i den ene side af bagsiden af mus.
- Fjern forsigtigt nålen fra injektionsstedet for at forhindre lækage af matrixgelblandingen. Kontroller, om der er en lille pukkel på injektionsstedet (figur 1).
- Placer musen på varmepuden i 2 minutter for at lade matrixgelblandingen koagulere og danne stik.
- Gentag trin 5.2. til 5.4. for at oprette stik på den anden side af bagsiden af musen. Marker kanterne på puklerne ved hjælp af en markørpen.
- Observer musen, indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Sæt musen i et separat bur, indtil det er helt genoprettet. Opstald musene i forsøgsdyrelaboratorium i SPF-klassen ved 22 ± 2 °C med en 12 timers lys/mørk cyklus i 7 dage.
6. Dextran-FITC-injektion gennem halevenen
- Efter 7 dages matrixgelinjektion resuspenderes 0,5 mg dextran-FITC med 500 μL dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og derefter voldsomt hvirvel for at opnå dextran-FITC-opløsningen ved den endelige koncentration på 1 μg/μL.
BEMÆRK: Brug dextran-FITC med molekylvægt på ~ 150 kDa til angiogeneseanalyse, og brug dextran-FITC med molekylvægt på ~ 4 kDa til vaskulær permeabilitetsanalyse. - Læg 50 μL dextran-FITC-opløsning i 29G-sprøjterne.
- Fastgør musen på haleveneinjektionsinstrumentet. Rens halen med 75% alkohol bomuldskugle og injicer forsigtigt 50 μL dextran-FITC gennem halevenen.
- Komprimer injektionsstedet med vatpind i 1 min for at standse blødningen, og sæt derefter musene tilbage i buret i 30 minutter.
- Gentag trin 6.3. og 6.4. indtil alle mus har fået dextran-FITC-injektion.
7. Opsamling af matrixgelstik
- Intraperitonealt injicere 1% pentobarbitalnatrium i PBS (200 mg / kg legemsvægt) og aflive musene med en IACUC godkendt procedure.
- Skær huden langs stikkets markerede kant ved hjælp af kirurgisk saks, og fjern huden over matrixgelproppen.
- Opsaml proppen og skyl i et lille bægerglas med 1x PBS for at vaske overskydende blod væk (figur 2A). Stikkets farve kan groft afgrænse graden af blodoverflod og indholdet af neo-kar (figur 3A).
8. Indlejring af matrixgelprop og sektionsforberedelse
- Dæk knappen på vævsindlejringskassetten med ca. 0,5 ml vævsindlejringsgel, og anbring derefter straks matrixgelproppen på vævsindlejringsgelen i den ønskede retning som vist i figur 2B. Indlejr derefter stikket med yderligere vævsindlejringsgel.
- Sæt kassetterne i en -80 °C fryser i 12 timer for at størkne.
- Til forberedelse af tyk sektion tages den størknede stikblok ud og skæres 12 μm tykke sektioner ved hjælp af frysemikrotomet i henhold til instruktionen og monteres på mikroskopglas.
- Skær 5-10 sektioner fra hver stikblok.
9. Kvantificering af angiogenese (figur 3)
- Få fluorescensbilleder fra 5 uafhængige felter i sektionen med et inverteret fluorescensmikroskop ved 488 nm bølgelængde under 10x forstørrelse.
- Åbn billedfilen med Image J-software (https://imagej.en.softonic.com/), og klik på knappen Angiogeneseanalyse . Klik derefter på Analyser HUVEC fasekontrast knappen, og skift til Stat-resultattabel for at indsamle oplysninger. Mål alle 5 erhvervede fluorescensbilleder for hvert afsnit.
- Analyser den samlede længde af neo-fartøjer fra forskellige grupper for statistisk at evaluere forskellen i angiogenese mellem disse grupper.
BEMÆRK: Samlet længde af mastersegmenter angiver den samlede længde af neo-fartøjer. Reagenset, der øger længden af neo-kar, kaldes pro-angiogent, mens reagenset, der reducerer længden af neo-kar, er anti-angiogent.
10. Kvantificering af vaskulær permeabilitet (figur 4)
- Få fluorescensbilleder fra 5 uafhængige felter i sektionen med et inverteret fluorescensmikroskop ved 488 nm bølgelængde under 20x forstørrelse.
- Åbn billedfilen med Image J-software. Klik på knappen Frihåndsvalg , og cirkel lækageområdet, klik derefter på menuen Analysér , og vælg indstillingen Mål for at få områdeoplysningerne om lækageområdet. Brug forholdet mellem lækageområde og billedområde til at indikere vaskulær permeabilitet.
- Analyser forholdet mellem lækageområde og areal af billedet fra forskellige grupper for statistisk at evaluere forskellen i vaskulær permeabilitet mellem disse grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er rutediagrammet, der viser, hvordan man forbereder blandingen af matrixgel, vaskulære celler, dyrkningsmedium og reagens. Blandingen blev derefter subkutant injiceret i bagsiden af Nu/Nu-mus og opvarmet ved hjælp af en varmepude for at fremskynde dens koagulation for endelig at danne gelprop.
Figur 2A er rutediagrammet til angivelse af skibe med fluorescerende mærket dextran. Fluorescerende mærket dextran blev injiceret via halevenen og cirklen i 30 minutter, så det kan komme ind i den funktionelle beholder i gelproppen. Derefter blev gelpropperne opsamlet, indlejret ved hjælp af vævsindlejringsgel (orienteringen af matrixgel, når den var indlejret, blev angivet i figur 2B). En 12 μm tyk sektion blev skåret fra propperne (5 skiver fra hver side), og fluorescerende billeder blev taget til kvantitativ analyse af angiogenese og / eller vaskulær permeabilitet.
Figur 3 er indflydelsen af antiangiogent reagenspalmitat og proangiogent reagens fibroblastvækstfaktor 1 (FGF1) på angiogenese i gelproppen. Figur 3A er udseendet af gelpropper med køretøj, palmitat eller FGF1. Blod kan komme ind i det funktionelle neo-kar i gelproppen, hvilket gør proppen rød i varierende grad. Figur 3B er det fluorescerende billede af matrixgelpropper, hvor de funktionelle kar blev visualiseret af dextran-FITC med høj molekylvægt. Figur 3C er det kvantitative resultat af fartøjslængden i forskellige grupper. Palmitat kan reducere længden af neo-kar betydeligt, mens FGF1-behandling naturligvis kan øge længden.
Figur 4 sammenligner vaskulær permeabilitet i gelpropper med eller uden vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) behandling. Figur 4A er det fluorescerende billede af matrixgelpropper, hvor lækageområdet visualiseres af dextran-FITC med lav molekylvægt og angives med pile. Figur 4B viser det kvantitative resultat af udsivningsområdet. Det øgede lækageområde i VEGF-behandlingsgruppen afslørede, at VEGF kan øge vaskulær permeabilitet.
Figur 1. Rutediagram, der viser dannelsen af en gelprop i mus. Vaskulære celler dyrket i monolagskultur dissocieres, pelleteres, resuspenderes med endotelcellemedium (ECM) og tælles (I-IV). Efter pelletering og resuspension i matrixgelblanding (indeholdende 8,8 volumenmatrixgel, 1 volumen 10x M199 suppleret med 10% FBS og 0,2 volumenreagens) blev 300 μL gelblanding injiceret subkutant i bagsiden af musene (V-VII) for at danne propper. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Rutediagram, der viser dextran-FITC-injektion og kvantificering af angiogenese. (A) Dextran-FITC blev injiceret via halevenen (I). Efter 30 minutter blev gelproppen erhvervet, indlejret, og sektioner blev skåret ved hjælp af frysemikrotomt (II, III). Derefter blev fluorescensbilleder taget ved hjælp af fluorescensmikroskop (IV), og angiogenese blev kvantitativt analyseret ved hjælp af Image J-software (V). (B) Diagrammet over matrixgelproporientering, når den er indlejret i vævsindlejringskassette. Forkortelser: OCT = optimal skæretemperaturblanding. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Evaluering af angiogenese ved anvendelse af modificeret matrixgelstikassay. (A) Udseende af repræsentative matrixgelpropper. (B) Det fluorescerende billede af funktionelle beholdere i matrixgelpropper angivet af Dextran-FITC. C) Den kvantitative analyse af længden af funktionelle beholdere i matrixgelpropper ved hjælp af envejs ANOVA. *p<0,05 i forhold til køretøjet; p<0.001 versus køretøj. Skalabjælken er 100 μm. Forkortelser: FGF1 = Fibroblast vækstfaktor 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Evaluering af vaskulær permeabilitet ved anvendelse af modificeret matrixgelstikassay. (A) Det repræsentative fluorescensbillede af beholdere i gelprop, pilene angiver lækagestedet. (B) Den kvantitative analyse af lækageområdet for at evaluere vaskulær permeabilitet ved hjælp af elevens t-test. s<0.001. Skalabjælken er 100 μm. Forkortelser: VEGF = vaskulær endotelvækstfaktor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer en pålidelig og bekvem metode til kvantitativ evaluering af angiogenese in vivo uden farvning. I denne protokol blev vaskulære celler blandet med matrixgel i nærvær af proangiogene eller antiangiogene reagenser og derefter subkutant injiceret i bagsiden af Nu/Nu-mus for at danne gelprop (figur 1). Efter 7 dages gelpropdannelse blev dextran-FITC injiceret intravenøst og cirkuleret i 30 minutter. Gelproppen blev opsamlet og indlejret med vævsindlejringsgel, og 12 μm sektioner blev skåret til fotografering (figur 2). Dextran-FITC kan indikere funktionelle kar uden farvning, og længden af neo-kar kan bruges til kvantitativt at evaluere reagensernes pro-angiogene eller anti-angiogene funktion. I eksemplet præsenteret i denne protokol reducerede palmitatbehandling længden af neo-kar, mens FGF1 øgede længden af neo-kar (figur 3), hvilket indikerede, at palmitat er anti-angiogent, mens FGF1 er pro-angiogen. Derudover kan denne protokol også anvendes til evaluering af vaskulær permeabilitet (figur 4).
Der skal udvises forsigtighed ved valg af recipientmus, håndtering og injektion af matrixgelen, opsamling af gelpropper og detektering af beholdernes længde. Immundefekte mus i alderen 6-8 uger anbefales, selvom C57BL/6-mus også er brugbare. I betragtning af variationen i stikket anbefales 3-5 stik i hver gruppe. Antallet af vaskulære celler skal være lige mellem forskellige grupper. Matrixgel skal håndteres omhyggeligt i henhold til instruktionerne og bør ikke anvendes, hvis den er størknet eller indeholder partikler eller adskillige bobler. I matrixgelforberedelsestrinnet bør den endelige koncentration af matrixgel ikke være mindre end 80%, og hvirvel er ikke tilladt, da der kan dannes bobler. Det skal bemærkes, at formen af gelproppen kan påvirke reproducerbarheden af resultaterne, så varmepuden blev brugt til at fremskynde størkningen af matrixgelproppen. En 37 °C dyreinkubator kan også anvendes. Derudover skal stik og sektioner beskyttes mod stærkt lys under indlejring af gelpropper og sektionsforberedelse, og fotos skal tages under et fluorescensmikroskop så hurtigt som muligt.
Blandt de forskellige in vivo angiogeneseanalyser er matrixgelpropanalysen en af de mest anvendte metoder, fordi den er alsidig, billigere og nem at udføre11. Imidlertid er farvningsprocessen i almindelig matrixgelstikanalyse udsat for fejl. Stikket er skrøbeligt og med højt vandindhold. Dehydrerings- og fikseringstrinnene, der er inkluderet i farvningsprocessen, kan forvrænge gelproppen og yderligere påvirke evalueringen af beholdernes længde. Derudover kan de spredte vaskulære celler i stikket farves og genkendes som funktionelle kar i almindelig matrixgelstikanalyse. En af de vigtigste fordele ved denne modificerede matrixgelpropanalyse er, at de funktionelle beholdere kan visualiseres uden farvning. FITC-mærket dextran blev brugt til at angive skibe, og kun funktionelle kar, der har blodgennemstrømning, kan angives, hvilket bidrager til bekvemmeligheden og pålideligheden af dette assay.
Udover længden af neo-fartøjer påvirker permeabiliteten også funktionen af neo-fartøjer20. Fluorescerende mærket dextran med lav molekylvægt (~ 4.400 Da) kan passere gennem hullet i kar og kan bruges til at indikere permeabiliteten af neo-fartøjer. Hvis det er nødvendigt, kan forskere evaluere både angiogenese og vaskulær permeabilitet i samme gelprop ved at bruge både fluorescerende mærket dextran med lav molekylvægt og det med høj molekylvægt21.
Angiogenese kan påvirkes af in vivo-miljøet 22, såsom diabetes 13,14,19 osv. Dette in vivo-miljø er svært at reproducere i disse in vitro-modeller. I denne modificerede protokol kan in vivo-miljøet imidlertid let reproduceres ved at vælge korrekte modtagermus. Derudover påvirker interaktionen mellem forskellige vaskulære celler også processen med angiogenese. Forskellige slags vaskulære celler, herunder endotelceller, glatte muskelceller og pericytter, kan tilsættes for at danne neo-kar i stikket i denne protokol for at undersøge bidraget fra forskellige vaskulære celler i angiogenese.
Der er dog også nogle begrænsninger for denne metode. Dannelsen af neo-skibe kan påvirkes af formen af gelproppen. Desuden er de neo-kar, der dannes i gelpluggen, ikke engang. Der er flere funktionelle kar i kanten af gelproppen end i midten (figur 2A). Resultaterne kan således påvirkes af udøverens færdigheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY22H020005) og National Natural Science Foundation of China (81873466).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
