Summary
Metoden som presenteres her kan evaluere effekten av reagenser på angiogenese eller vaskulær permeabilitet in vivo uten farging. Metoden bruker dextran-FITC injeksjon via halevenen for å visualisere neo-kar eller vaskulær lekkasje.
Abstract
Flere modeller er utviklet for å undersøke angiogenese in vivo. Imidlertid er de fleste av disse modellene komplekse og dyre, krever spesialutstyr, eller er vanskelige å utføre for påfølgende kvantitativ analyse. Her presenterer vi en modifisert matriks gelplugganalyse for å evaluere angiogenese in vivo. I denne protokollen ble vaskulære celler blandet med matriksgel i nærvær eller fravær av proangiogene eller antiangiogene reagenser, og deretter subkutant injisert på baksiden av mottakermus. Etter 7 dager injiseres fosfatbuffersaltvann inneholdende dekstran-FITC via halevenen og sirkuleres i kar i 30 minutter. Matriksgelplugger samles og bygges inn med vevsinnbyggingsgel, deretter kuttes 12 μm seksjoner for fluorescensdeteksjon uten farging. I denne analysen kan dextran-FITC med høy molekylvekt (~ 150 000 Da) brukes til å indikere funksjonelle kar for å oppdage lengden, mens dextran-FITC med lav molekylvekt (~ 4 400 Da) kan brukes til å indikere permeabiliteten til neo-fartøy. Avslutningsvis kan denne protokollen gi en pålitelig og praktisk metode for den kvantitative studien av angiogenese in vivo.
Introduction
Angiogenese, prosessen med dannelse av neo-fartøy fra eksisterende kar, spiller en kritisk rolle i mange fysiologiske og patologiske prosesser, som embryonisk utvikling, sårheling, aterosklerose, tumorutvikling, etc.1,2,3,4,5. Denne dynamiske prosessen innebærer flere trinn, inkludert nedbrytning av matrisen, vaskulær celleproliferasjon, migrasjon og selvorganisering for å danne rørformede strukturer og stabilisering av neo-fartøyene6. Fremme av angiogenese har vist seg å være kritisk ved behandling av hjerteinfarkt, hjerneslag og andre typer iskemiske sykdommer7 mens hemming av angiogenese har blitt ansett som en lovende strategi i behandlingen av kreft8 og revmatoid sykdom9. Angiogenese har vært ansett som et organiserende prinsipp for legemiddeloppdagelse10. Dermed er konstruksjonen av en pålitelig og praktisk metode for å vurdere omfanget av angiogenese kritisk for mekanisk forskning eller legemiddeloppdagelse i angiogeneseavhengige sykdommer.
Flere in vitro og in vivo modeller er utviklet for å evaluere angiogenese11. Blant disse kan todimensjonale (2-D) modeller, som matriksgelrørdannelsesanalyse12, ikke danne funksjonelle rørformede strukturer. Dyremodellene, som bakre lem iskemi modell13,14, kan reprodusere angiogeneseprosessen, men er komplekse og krever et laserflekkblodstrømsavbildningssystem. 3D-modeller av vaskulær morfogenese, som matriksgelplugganalyse, gir en enkel plattform som kan etterligne angiogeneseprosessen in vivo15, men påvisning av angiogenese krever immunhistokjemi eller immunfluorescensfarging 16,17,18, som er variable og dårlig visualisert.
Her beskriver vi en protokoll for en modifisert matriksgelplugganalyse der vaskulære celler ble blandet med matriksgel og subkutant injisert på baksiden av mus for å danne en plugg. I pluggen må vaskulære celler nedbryte matrisen, spre seg, migrere og selvorganisere for endelig å danne funksjonelle kar med blodstrøm i det indre miljøet. Deretter injiseres fluorescerende merket dextran via halevenen for å strømme gjennom pluggen, og etiketten visualiseres for å indikere neo-fartøy. Innholdet av angiogenese kan kvantitativt evalueres av fartøyets lengde. Denne metoden kan danne funksjonelle kar som ikke kan produseres i 2-D angiogenesemodeller12, og trenger ikke kompleks flekkprosess som i vanlig matriksgelplugganalyse11. Det krever heller ikke dyre spesifikke instrumenter som laser speckle blood flow imaging system i baklem iskemi modell 13,14,19. Denne metoden er allsidig, billig, kvantifiserbar og enkel å utføre, og kan brukes til å bestemme pro- eller anti-angiogen evne til legemidler eller brukes i mekanisk forskning involvert i angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyreforsøkspersoner ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19. juli 2021). Alle reagenser og forbruksvarer er oppført i materialfortegnelsen.
1. Kultur medium forberedelse
- 10x M199 kulturmedium: Løs opp M199 pulver til 10x konsentrasjon med 90 ml avionisert vann og tilsett 10 ml føtal bovint serum (FBS), og pass deretter gjennom et 0,22 μm filter. Oppbevar mediet ved 4 °C i opptil 2 måneder.
- Komplett endotelkulturmedium: Tilsett 50 ml FBS, 5 ml penicillin / streptomycin og 5 ml endotelcelleveksttilskudd til 460 ml endotelcellemedium (ECM). Oppbevar mediet ved 4 °C i opptil 1 måned.
2. Vaskulær cellepreparasjon
- Dyrkning 1 x 105 vaskulære celler (primære dyrkede endoteliale stamceller14, endotelceller eller endotelcellelinjer) med 8 ml komplett endoteldyrkningsmedium i 100 mm vevskulturskål ved 37 °C og 5 % CO2 til 70 % konfluens.
- Fjern kulturmediet og skyll parabolen 2x med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne ufestede celler og rusk. Fjern PBS og tilsett 3 ml 0,25% trypsin inneholdende 2,21 mM EDTA, og inkuber ved 37 °C i 1 min.
- Nøytraliser trypsinet med 7 ml komplett endotelkulturmedium, og skyll forsiktig celler av kulturfatet. Bekreft celleavløsning under et lysmikroskop (40x forstørrelse).
- Samle cellesuspensjon i et 15 ml rør og sentrifuge ved 400 x g i 10 minutter. Fjern supernatant og resuspender celler med 5 ml komplett endotelkulturmedium.
- Telle celler ved hjelp av et hemocytometer og flytte suspensjon inneholdende 2 x 106 celler til en steril 1,5 ml rør. Hver plugg inneholder 1,5 x 106 celler, ytterligere 25% celler brukes i tilfelle avfall. Hver gruppe inneholder minst 3 plugger.
MERK: Etter forsøk ble det funnet at 1,5 x 106 celler i 300 μL matriksgel førte til riktig utvikling av angiogenese og ble derfor valgt for eksperimentering. - Sentrifugecellesuspensjon ved 400 x g i 5 minutter til pelletsceller, og fjern deretter supernatant.
3. Fremstilling av matriksgel
- Forkjøl sterile 1,5 ml tuber som inneholder cellepellet i et vannbad på 4 °C. Forkjøl 30G 1 ml insulinsprøyter i kjøleskap på 4 °C.
- Tine matriksgel helt i et vannbad på 4 °C. Ikke bland eller virvel. Forkjøl 10x M199 og test reagens/medikament av interesse i et 4 °C vannbad.
- Bland forkjølt matriksgel med 10x M199 inneholdende 10% FBS og reagenset som skal testes i et volumforhold på 8.8: 1: 0.2 for å få en matriksgel og M199-blanding inneholdende 1% FBS og reagenset.
- Resuspendere celler med 400 μL av matriksgelblandingen, bland forsiktig for å unngå å danne bobler. Hold tuben på is til mus er klargjort for injeksjon. Hold matriksgelblandingen på is hele tiden for å unngå koagulasjon.
MERK: Her ble 300 μL matriksgelblanding inneholdende 1,5 x 106 celler brukt til å danne gelplugg. Forbered 25% ekstra gel i henhold til 25% ekstra celler i trinn 2.
4. Forberedelse av mus
- Bedøv 6-8 uker gammel mannlig Nu/Nu-mus (18-25 g) i kammeret til dyreanestesiapparatet med isofluran (3 % isofluran i 100 % oksygen ved strømningshastighet 1 l/min). Etter vellykket bedøvelse, bekreftet ved fravær av rettingsrefleks og tåklemmerefleks, flytt musen ut av kammeret, flytt musen ut av kammeret og legg en anestesimaske på musen og endre konsentrasjonen av isofluran til 1,5 % i 100 % oksygen ved en strømningshastighet på 1 l/min.
NOTAT: Gi termisk støtte til dyret ved hjelp av en varmepute gjennom hele prosedyren. - Bruk veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet. Teip musens lemmer på operasjonsbrettet i utsatt stilling.
5. Matrix gel blanding injeksjon
- Legg 300 μL av matriksgelblandingen i en 1 ml insulinsprøyte med en 30G nål. Unngå bobledannelse. Legg raskt i matriksgelen (innen 2 minutter) for å unngå størkning i løpet av denne tiden. Legg insulinsprøyten med matriksgel på is umiddelbart.
- Rengjør huden på baksiden av mus med 75% alkoholputer. Injiser subkutant 300 μL matriksgelblanding i den ene siden av musens bakside.
- Fjern kanylen forsiktig fra injeksjonsstedet for å forhindre lekkasje av matriksgelblandingen. Se etter en liten pukkel på injeksjonsstedet (figur 1).
- Plasser musen på varmeputen i 2 min for å la matriksgelblandingen koagulere og danne plugg.
- Gjenta trinn 5.2. til 5.4. for å lage plugg på den andre siden av baksiden av musen. Merk kantene på puklene med en markørpenn.
- Observer musen til den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Sett musen i et eget bur til den er fullstendig gjenopprettet. Oppbevar musene i SPF-klasse eksperimentelt dyrelaboratorium ved 22 ± 2 ° C med en 12 timers lys / mørk syklus i 7 dager.
6. Dextran-FITC injeksjon gjennom halen venen
- Etter 7 dager med matriksgelinjeksjon, resuspender 0,5 mg dekstran-FITC med 500 μL dobbeltdestillert vann (ddH2O) og deretter voldsomt virvel for å oppnå dextran-FITC-løsningen ved den endelige konsentrasjonen på 1 μg / μL.
MERK: Bruk dextran-FITC med molekylvekt på ~ 150 kDa for angiogeneseanalyse, og bruk dextran-FITC med molekylvekt på ~ 4 kDa for vaskulær permeabilitetsanalyse. - Legg 50 μL dextran-FITC-oppløsning i 29G-sprøytene.
- Fest musen på injeksjonsinstrumentet i halevenen. Rengjør halen med 75% alkohol bomullsdott og injiser forsiktig 50 μL dextran-FITC gjennom halevenen.
- Komprimer injeksjonsstedet med bomullspinne i 1 min for å stanse blødningen, og sett deretter musene tilbake i buret i 30 minutter.
- Gjenta trinn 6.3. og 6.4. inntil alle mus har fått dekstran-FITC-injeksjon.
7. Matrix gelplugg samling
- Intraperitonealt injisere 1% pentobarbitalnatrium i PBS (200 mg / kg kroppsvekt) og avlive musene med en IACUC godkjent prosedyre.
- Klipp huden langs den markerte kanten av pluggen ved hjelp av kirurgisk saks og fjern huden over matriksgelpluggen.
- Samle pluggen og skyll i et lite beger med 1x PBS for å vaske bort overflødig blod (figur 2A). Fargen på pluggen kan grovt avgrense graden av blodmengde og innholdet av neo-fartøy (figur 3A).
8. Embedding matrix gel plug og seksjon forberedelse
- Dekk knappen på vevsembeddingskassett med ca. 0,5 ml vevsinnebyggingsgel, og plasser deretter matriksgelpluggen umiddelbart på vevsembeddinggelen i ønsket retning som vist i figur 2B. Deretter legger du pluggen med ekstra vevsembeddingsgel.
- Sett kassettene i en fryser på -80 °C i 12 timer for å stivne.
- For forberedelse av tykk seksjon, ta ut den størknede pluggblokken og kutt 12 μm tykke seksjoner ved hjelp av frysemikrotomen i henhold til instruksjonene, og monter på mikroskoplysbilder.
- Skjær 5-10 seksjoner fra hver pluggblokk.
9. Kvantifisering av angiogenese (figur 3)
- Skaff fluorescensbilder fra 5 uavhengige felt i seksjonen med et invertert fluorescensmikroskop ved 488 nm bølgelengde under 10x forstørrelse.
- Åpne bildefilen med Image J-programvare (https://imagej.en.softonic.com/) og klikk på Angiogenesis Analyze-knappen . Klikk deretter Analyser HUVEC fasekontrast knappen, og bytt til Stat Results Table for å samle informasjon. Mål alle 5 ervervede fluorescensbilder for hver seksjon.
- Analyser den totale lengden av neo-fartøy fra forskjellige grupper for statistisk å evaluere forskjellen i angiogenese mellom disse gruppene.
MERK: Total lengde på mastersegmenter angir den totale lengden på neo-fartøy. Reagenset som øker lengden på neo-fartøy kalles pro-angiogen, mens reagenset som reduserer lengden på neo-fartøy er anti-angiogen.
10. Kvantifisering av vaskulær permeabilitet (figur 4)
- Skaff fluorescensbilder fra 5 uavhengige felt i seksjonen med et invertert fluorescensmikroskop ved 488 nm bølgelengde under 20x forstørrelse.
- Åpne bildefilen med Image J-programvare. Klikk på Frihåndsvalg-knappen og sett ring rundt lekkasjeområdet, klikk deretter på Analyser-menyen og velg alternativet Mål for å få områdeinformasjon om lekkasjeområdet. Bruk forholdet mellom lekkasjeområdet og bildeområdet for å indikere vaskulær permeabilitet.
- Analyser forholdet mellom lekkasjeområde og område av bildet fra forskjellige grupper for å statistisk evaluere forskjellen i vaskulær permeabilitet mellom disse gruppene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er flytskjemaet som viser hvordan blandingen av matriksgel, karceller, dyrkningsmedium og reagens skal fremstilles. Blandingen ble deretter subkutant injisert på baksiden av Nu/Nu-mus og oppvarmet ved hjelp av en varmepute for å akselerere koagulasjonen for til slutt å danne gelplugg.
Figur 2A er flytskjemaet for å indikere fartøy med fluorescerende merket dextran. Fluorescerende merket dextran ble injisert via halevenen og sirkelen i 30 minutter, slik at den kan komme inn i funksjonsbeholderen i gelpluggen. Deretter ble gelpluggene samlet, innebygd ved hjelp av vevsembeddinggel (orienteringen av matriksgel når den var innebygd ble indikert i figur 2B). Et tykt snitt på 12 μm ble skåret ut av pluggene (5 skiver fra hver side) og fluorescerende bilder ble tatt for kvantitativ analyse av angiogenese og/eller vaskulær permeabilitet.
Figur 3 er påvirkning av antiangiogen reagenspalmitat og proangiogen reagens fibroblastvekstfaktor 1 (FGF1) på angiogenese i gelpluggen. Figur 3A er utseendet på gelplugger med kjøretøy, palmitat eller FGF1. Blod kan komme inn i den funksjonelle neo-beholderen i gelpluggen, noe som gjør pluggen rød i varierende grad. Figur 3B er det fluorescerende bildet av matriksgelplugger, der de funksjonelle karene ble visualisert av dextran-FITC med høy molekylvekt. Figur 3C er det kvantitative resultatet av fartøyets lengde av forskjellig gruppe. Palmitat kan redusere lengden på neo-fartøy betydelig, mens FGF1-behandling åpenbart kan øke lengden.
Figur 4 sammenligner vaskulær permeabilitet hos gelpropper med eller uten behandling med vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). Figur 4A er det fluorescerende bildet av matriksgelplugger, der lekkasjeområdet visualiseres av dextran-FITC med lav molekylvekt og indikert med piler. Figur 4B er det kvantitative resultatet av lekkasjeareal. Det økte lekkasjeområdet i VEGF-behandlingsgruppen viste at VEGF kan øke vaskulær permeabilitet.
Figur 1. Flytskjema som viser dannelse av en gelplugg hos mus. Vaskulære celler dyrket i monolagskultur dissosieres, pelleteres, resuspenderes med endotelcellemedium (ECM) og telles (I-IV). Etter pelletering og resuspensjon i matriksgelblanding (inneholdende 8,8 volummatriksgel, 1 volum 10x M199 tilsatt 10% FBS og 0,2 volumreagens), ble 300 μL gelblanding subkutant injisert på baksiden av musene (V-VII) for å danne plugger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Flytskjema som viser dextran-FITC injeksjon og kvantifisering av angiogenese. (A) Dextran-FITC ble injisert via halevenen (I). Etter 30 min ble gelplugg anskaffet, innebygd og seksjoner ble skåret med frysemikrotome (II, III). Deretter ble fluorescensbilder tatt med fluorescensmikroskop (IV) og angiogenese ble kvantitativt analysert ved hjelp av Image J-programvare (V). (B) Diagrammet over matriksgelpluggorientering når den er innebygd i vevsinnebyggingskassett. Forkortelser: OCT = optimal skjæretemperaturforbindelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Evaluering av angiogenese ved bruk av modifisert matriksgelplugganalyse. (A) Utseende av representative matriksgelplugger. (B) Det fluorescerende bildet av funksjonelle kar i matriksgelplugger indikert av Dextran-FITC. (C) Den kvantitative analysen av lengden på funksjonelle kar i matriksgelplugger ved bruk av enveis ANOVA. *p<0,05 versus kjøretøy; s<0.001 versus kjøretøy. Skalastangen er 100 μm. Forkortelser: FGF1 = Fibroblast vekstfaktor 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Evaluering av vaskulær permeabilitet ved hjelp av modifisert matriksgelplugganalyse. (A) Det representative fluorescensbildet av fartøy i gelplugg, pilene indikerer lekkasjested. (B) Den kvantitative analysen av lekkasjeområdet for å evaluere vaskulær permeabilitet ved bruk av Student t-test. s<0.001. Skalastangen er 100 μm. Forkortelser: VEGF = vaskulær endotelial vekstfaktor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en pålitelig og praktisk metode for kvantitativ evaluering av angiogenese in vivo uten farging. I denne protokollen ble vaskulære celler blandet med matriksgel i nærvær av proangiogene eller antiangiogene reagenser, og deretter subkutant injisert på baksiden av Nu/Nu-mus for å danne gelplugg (figur 1). Etter 7 dager med dannelse av gelplugger ble dekstran-FITC injisert intravenøst og sirkulert i 30 minutter. Gelpluggen ble samlet opp og innebygd med vevsembeddingsgel, og 12 μm seksjoner ble skåret opp for fotografering (figur 2). Dextran-FITC kan indikere funksjonelle kar uten farging, og lengden på neo-fartøy kan brukes til kvantitativt å evaluere den pro-angiogene eller anti-angiogene funksjonen til reagenser. I eksemplet som presenteres i denne protokollen, reduserte palmitatbehandling lengden på neo-fartøy, mens FGF1 økte lengden på neo-fartøy (figur 3), noe som indikerte at palmitat er anti-angiogen, mens FGF1 er pro-angiogen. Dessuten kan denne protokollen også brukes i evalueringen av vaskulær permeabilitet (figur 4).
Forsiktighet bør utvises ved valg av mottakermus, håndtering og injeksjon av matriksgelen, oppsamling av gelplugg og påvisning av lengden på karene. Immundefekte mus i alderen 6-8 uker anbefales, selv om C57BL/6 mus også er brukbare. Med tanke på variasjonen i pluggen, anbefales 3-5 plugger i hver gruppe. Antall vaskulære celler bør være jevnt mellom forskjellige grupper. Matrix gel skal håndteres forsiktig i henhold til instruksjonene og skal ikke brukes hvis den størkner eller inneholder partikler eller mange bobler. I matriksgelforberedelsestrinnet bør den endelige konsentrasjonen av matriksgel ikke være mindre enn 80%, og hvirvel er ikke tillatt da bobler kan dannes. Det skal bemerkes at formen på gelpluggen kan påvirke reproduserbarheten av resultatene, så varmepute ble brukt til å akselerere størkningen av matriksgelpluggen. En 37 °C dyrekuvøse kan også brukes. I tillegg bør plugger og seksjoner beskyttes mot sterkt lys under innebygging av gelplugger og seksjoner, og bilder skal tas under et fluorescensmikroskop så snart som mulig.
Blant de forskjellige in vivo angiogeneseanalysene er matriksgelplugganalysen en av de mest brukte metodene fordi den er allsidig, mindre kostbar og enkel å utføre11. Imidlertid er fargeprosessen i vanlig matriksgelplugganalyse utsatt for feil. Pluggen er skjør og med høyt vanninnhold. Dehydrerings- og fikseringstrinnene som inngår i fargeprosessen, kan forvride gelpluggen, og ytterligere påvirke evalueringen av karets lengde. Dessuten kan de spredte vaskulære cellene i pluggen farges og gjenkjennes som funksjonelle kar i vanlig matriksgelplugganalyse. En av de viktigste fordelene med denne modifiserte matriksgelplugganalysen er at de funksjonelle karene kan visualiseres uten farging. FITC-merket dextran ble brukt til å indikere fartøy, og bare funksjonelle kar som har blodstrøm kan indikeres, noe som bidrar til bekvemmeligheten og påliteligheten av denne analysen.
Foruten lengden på neo-fartøy, påvirker permeabiliteten også funksjonen til neo-fartøy20. Fluorescerende merket dextran med lav molekylvekt (~ 4,400 Da) kan passere gjennom gapet i kar og kan brukes til å indikere permeabiliteten til neo-fartøy. Om nødvendig kan forskere evaluere både angiogenese og vaskulær permeabilitet i samme gelplugg ved å bruke både fluorescerende merket dextran med lav molekylvekt og det med høy molekylvekt21.
Angiogenese kan påvirkes av in vivo miljø22, som diabetes 13,14,19, etc. Dette in vivo-miljøet er vanskelig å reprodusere i disse in vitro-modellene. I denne modifiserte protokollen kan imidlertid in vivo-miljøet enkelt reproduseres ved å velge riktige mottakermus. Dessuten påvirker samspillet mellom forskjellige vaskulære celler også angiogeneseprosessen. Ulike typer vaskulære celler, inkludert endotelceller, glatte muskelceller og pericytter, kan legges til for å danne neo-fartøy i pluggen i denne protokollen for å undersøke bidraget fra forskjellige vaskulære celler i angiogenese.
Det er imidlertid også noen begrensninger for denne metoden. Dannelsen av neo-fartøy kan påvirkes av formen på gelpluggen. Dessuten er neo-fartøyene dannet i gelpluggen ikke engang. Det er flere funksjonelle beholdere på kanten av gelpluggen enn den i midten (figur 2A). Dermed kan resultatene påvirkes av utøverens ferdighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY22H020005), og National Natural Science Foundation of China (81873466).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
