Summary
Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie nach der Einbettung von Epon unter Verwendung eines fluoreszierenden Proteins namens mScarlet. Diese Methode kann die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig aufrechterhalten. Diese Technik ist für eine Vielzahl biologischer Anwendungen geeignet.
Abstract
Die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist eine umfassende Mikroskopie, die die Lokalisierungsinformationen der Fluoreszenzmikroskopie (FM) und den Kontext der zellulären Ultrastruktur kombiniert, der durch die Elektronenmikroskopie (EM) erfasst wurde. CLEM ist ein Kompromiss zwischen Fluoreszenz und Ultrastruktur, und normalerweise beeinträchtigt die Ultrastruktur die Fluoreszenz. Im Vergleich zu anderen hydrophilen Einbettharzen wie Glycidylmethacrylat, HM20 oder K4M ist Epon in Bezug auf die Ultrastrukturkonservierung und die Trenneigenschaften überlegen. Zuvor hatten wir gezeigt, dass mEosEM die Fixierung von Osmiumtetroxid und die Epon-Einbettung überleben kann. Mit mEosEM haben wir zum ersten Mal ein Epon-Post-Embedding-CLEM erreicht, das die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig beibehält. Hier geben wir Schritt für Schritt Details über die EM-Probenvorbereitung, die FM-Bildgebung, die EM-Bildgebung und die Bildausrichtung. Wir verbessern auch die Verfahren zur Identifizierung derselben Zelle, die durch FM-Bildgebung während der EM-Bildgebung abgebildet wurde, und beschreiben die Registrierung zwischen den FM- und EM-Bildern. Wir glauben, dass man die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie nach der Einbettung von Epon nach diesem neuen Protokoll in traditionellen EM-Einrichtungen leicht erreichen kann.
Introduction
Die Fluoreszenzmikroskopie (FM) kann verwendet werden, um die Lokalisierung und Verteilung des Zielproteins zu erhalten. Der Kontext, der das Zielprotein umgibt, geht jedoch verloren, was für eine gründliche Untersuchung des Zielproteins entscheidend ist. Die Elektronenmikroskopie (EM) hat die höchste Bildauflösung und liefert mehrere subzelluläre Details. Dennoch fehlt es EM an einer Zielkennzeichnung. Durch die genaue Zusammenführung des von FM aufgenommenen Fluoreszenzbildes mit dem von EM aufgenommenen Graubild kann die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) die von diesen beiden Bildgebungsmodi erhaltenen Informationen kombinieren 1,2,3,4.
CLEM ist ein Kompromiss zwischen Fluoreszenz und der Ultrastruktur1. Aufgrund der Einschränkungen der derzeitigen fluoreszierenden Proteine und der traditionellen EM-Probenvorbereitungsverfahren, insbesondere der Verwendung von Osmisäure (OsO 4) und hydrophoben Harzen wie Epon, beeinträchtigt die Ultrastruktur immer die Fluoreszenz5. OsO4 ist ein unverzichtbares Reagenz in der EM-Probenvorbereitung, das zur Verbesserung des Kontrasts von EM-Bildern eingesetzt wird. Im Vergleich zu anderen Einbettungsharzen ist Epon in Bezug auf die Ultrastrukturkonservierung und die Trenneigenschaftenüberlegen 5. Allerdings können keine fluoreszierenden Proteine das Fluoreszenzsignal nach der Behandlung von OsO4 und Epon-Einbettung6 speichern. Um die Einschränkungen fluoreszierender Proteine zu überwinden, wurde ein Pre-Embedding-CLEM entwickelt, bei dem die FM-Bildgebung vor der EM-Probenvorbereitung durchgeführt wird6. Der Nachteil der Voreinbettung von CLEM ist jedoch die ungenaue Registrierung zwischen den FM- und EM-Bildern5.
Im Gegensatz dazu führt die CLEM-Methode nach dem Einbetten die FM-Bildgebung nach der EM-Probenvorbereitung durch, deren Registrierungsgenauigkeit 6-7 nm erreichen kann 5,6. Um die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine zu erhalten, wurden sehr niedrige Konzentrationen von OsO4 (0,001%)3 oder die Hochdruck-Gefrier- (HPF) und Gefriersubstitutions- (FS) EM-Präparationsmethoden 4,7 auf Kosten der beeinträchtigten Ultrastruktur oder des Kontrasts des EM-Bildes verwendet. Die Entwicklung von mEos4b fördert den Fortschritt von CLEM nach der Einbettung erheblich, obwohl Glycidylmethacrylat als Einbettharzverwendet wird 5. Mit der Entwicklung von mEosEM, dasdie OsO4-Färbung und Epon-Einbettung überleben kann, wurde zum ersten Mal eine superauflösende EPON-Post-Embedding-CLEM erreicht, bei der die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig erhaltenbleiben 6. Nach mEosEM wurden mehrere fluoreszierende Proteine entwickelt, die dieOsO4-Färbung und die Epon-Einbettung überleben können 8,9,10,11. Dies fördert die Entwicklung von CLEM erheblich.
Es gibt drei Schlüsselaspekte für Epon nach der Einbettung von CLEM. Das erste ist das fluoreszierende Protein, das das Fluoreszenzsignal nach der EM-Probenvorbereitung aufrechterhalten soll. Nach unserer Erfahrung ist mScarlet anderen fluoreszierenden Proteinen überlegen. Die zweite ist, wie man dieselbe Zelle findet, die durch FM-Bildgebung in der EM-Bildgebung abgebildet wurde. Um dieses Problem zu lösen, verbessern wir das Verfahren für diesen Schritt, so dass man die Zielzelle leicht finden kann. Die letzte ist die Methode zum Ausrichten des FM-Bildes am EM-Bild. Hier beschreiben wir die Registrierung zwischen den FM- und EM-Bildern. In diesem Protokoll exprimieren wir mScarlet in VGLUT2-Neuronen und zeigen, dass mScarlet sekundäre Lysosomen mit Hilfe von Epon nach der Einbettung von CLEM angreifen kann. Wir bieten Schritt-für-Schritt-Details für Epon nach der Einbettung von CLEM, ohne die Fluoreszenz und die Ultrastruktur zu beeinträchtigen.
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Protocol
Tierhaltung und -versuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Fujian Medical University Medical Center genehmigt. Der Schritt-für-Schritt-Workflow des aktuellen Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Probenvorbereitung
- Mäusegehirn
- Kaufen Sie transgene Mäuse (siehe Materialtabelle) und Oligonukleotid-Primer (siehe Materialtabelle), um diese Mäuse zu genotypisieren.
- Perfundierung und Entfernung des intakten Gehirns aus dem Schädelgewölbe gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll12,13.
- Fixieren Sie das Mäusegehirn mit 10 ml Fixierlösung (siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht.
- Spülen Sie die Fixierlösung 3 x 10 min mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB) ab.
- Schneiden Sie das Mäusegehirn mit einem oszillierenden Mikrotom in 500 μm dicke Schnitte (siehe Materialtabelle).
- Schneiden Sie die fluoreszierenden Bereiche mit einem Skalpell mit einem Stereomikroskop in kleine Blöcke (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Das Volumen der kleinen Blöcke darf nicht größer als 1 mm3 sein.
- Kultivierte Zellen
- HeLa-Zellen in 6 cm Zellkulturschalen säen und in Wachstumsmedium aufbewahren (Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium [DMEM] Low Glucose, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum [FBS]).
- Am folgenden Tag transfizieren Sie die mScarlet-haltigen Plasmide mit einem DNA-Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) gemäß der Anleitung des Transfektionskits in Zellen.
- Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion trypsinisieren Sie die transfizierten Zellen und zentrifugieren sie, um Zellpellets mit 1.000 × g zu erhalten. Die Zellpellets werden als Probenblöcke bezeichnet.
2. EM-Probenvorbereitung
- Fixierung
- Fixieren Sie die Probenblöcke mit einer Fixierlösung (siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht.
- Entfernen Sie die Fixierlösung und spülen Sie die Fixierlösung 3 x 10 min mit 0,1 M PB aus den Probenblöcken ab.
- Färbung von Osmiumtetroxid (OsO4)
- Die Probenblöcke werden 1 h lang mit OsO4-Lösung (siehe Materialtabelle) bei 4 °C fixiert.
- Entfernen Sie dieOsO 4-Lösung und spülen Sie dieOsO 4-Lösung 3 x 10 min mit ddH2O aus den Probenblöcken ab.
- Uranylacetat (UA)-Färbung
- Färben Sie die Probenblöcke mit 2%iger UA-Lösung (siehe Materialtabelle) bei 4 °C für 1 h.
- Entfernen Sie die UA-Lösung und spülen Sie die Probenblöcke 3 x 10 min lang mit ddH2O aus.
- Gradienten-Dehydrierung
- Die Probenblöcke werden wie folgt mit Gradientenethanol dehydriert: 50 % für 10 min, 70 % für 10 min, 80 % für 10 min, 90 % für 10 min und 2 x 10 min in 100 % Ethanol.
- Entwässern Sie die Probenblöcke 3 x 10 Minuten lang mit wasserfreiem Aceton.
- Harz-Infiltration
- Infiltrieren Sie die Probenblöcke mit Gradientenharz (siehe Materialtabelle): Aceton zu Harz 3:1 für 1 h, Aceton zu Harz 1:1 für 2 h, Aceton zu Harz 1:3 für 3 h.
- Durch das reine Harz für 3 x 12 h ersetzen.
- Einbettung von Harz
- Probenblöcke mit einem Zahnstocher in Kapseln (siehe Materialtabelle) umfüllen.
- Geben Sie reines Harz in die Kapsel mit dem Probenblock und polymerisieren Sie das Harz im Ofen bei 60 °C für 14-16 h.
3. Beschichtung des Deckglases mit Goldnanopartikeln
- Reinigung von Deckglas
- Waschen Sie die Deckgläser mit Reinigungspuffer (siehe Materialtabelle) für 2 h bei 142 °C.
- Spülen Sie den Reinigungspuffer 3 x 10 min mit ddH2O ab.
- Die Deckgläser vorsichtig in ein Becherglas mit wasserfreiem Ethylalkohol geben und über Nacht inkubieren.
- Trocknen Sie die Deckgläser einige Minuten lang an der Luft auf einer sauberen Bank.
- Beschichten Sie die Deckgläser mit Goldnanopartikeln.
- Befestigen Sie einen Objektträger in der Mitte der Drehung einer Tischzentrifuge (siehe Materialtabelle) mit Glaszement.
- Montieren Sie ein Deckglas in der Mitte des Objektträgers mit Haftnotizen.
- Geben Sie 75 μl 1% Pioloform (siehe Materialtabelle) auf das Deckglas.
HINWEIS: Wir haben Formvar auch getestet (siehe Materialtabelle) und es funktioniert gut. - 3 Minuten lang bei 1.360 × g (Abbildung 2A) drehen, um eine dünne Schicht Pioloform auf der Oberfläche des Deckglases zu erzeugen.
- Inkubieren Sie die Deckglasoberfläche mit 250 μl 0,1 % Poly-L-Lysin (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur (Abbildung 2B).
- Spülen Sie mit ddH2O und trocknen Sie das Deckglas einige Minuten lang an der Luft.
- 80 nm Goldnanopartikel (siehe Materialtabelle) mit ddH2O bis 25% (v/v, OD600 = 0,07) (siehe Materialtabelle) verdünnen und 15 min beschallen.
- Inkubieren Sie die Deckglasoberfläche mit den verdünnten Goldnanopartikeln für 1 h bei Raumtemperatur (Abbildung 2C).
- Spülen Sie mit ddH2O und trocknen Sie das Deckglas einige Minuten lang an der Luft.
HINWEIS: Es funktioniert gut 2 Wochen nach der Beschichtung mit Pioloform- und Goldnanopartikeln. Wir empfehlen jedoch, es sofort nach dem Beschichten zu verwenden.
4. Ultradünnes Schneiden
- Schneiden Sie die Oberfläche des Probenblocks in ein rechtwinkliges Trapez ab. Schneiden Sie Schnitte mit einer Dicke von 100 nm mit einem Diamantmesser (siehe Materialtabelle) mit einem Ultramikrotom (siehe Materialtabelle). Trennen Sie einen einzelnen Abschnitt vom Abschnittsband und lassen Sie den einzelnen Abschnitt im Wasserbad schwimmen.
- Geben Sie einen Tropfen ddH2O auf die Mitte des mit Goldnanopartikeln beschichteten Deckglases. Nehmen Sie einen Abschnitt mit einer Probenschleife auf und drehen Sie die Probenschleife auf die Oberfläche des Wassertropfens. Entfernen Sie die Probenschlaufe und lassen Sie den Abschnitt auf der Oberfläche des Wassertropfens.
- Trocknen Sie das Deckglas einige Minuten an der Luft. Zeichnen Sie mit einem Filzstift einen Ringring um den Abschnitt auf der gegenüberliegenden Seite des Deckglases.
5. Lichtmikroskopische Bildgebung
- Fluoreszenz-Wiederherstellung
HINWEIS: Der Arbeitsablauf ist in Abbildung 3A dargestellt.- Geben Sie 10 μl Montagepuffer (siehe Materialtabelle) auf den ultradünnen Abschnitt auf dem Deckglas. Setzen Sie ein neues, sauberes Deckglas auf den Montagepuffer.
HINWEIS: Die Schlüsselkomponente des Einhängepuffers ist DABCO, das zur Wiederherstellung der Fluoreszenz fluoreszierender Proteine verwendet wird. Dies ist für die Fluoreszenzrückgewinnung sehr wichtig. - Legen Sie diese beiden Deckgläser zusammen mit dem ultradünnen Schnitt in eine Bildgebungskammer (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass sich das Deckglas mit dem gezogenen Ring oben befindet.
- Geben Sie 10 μl Montagepuffer (siehe Materialtabelle) auf den ultradünnen Abschnitt auf dem Deckglas. Setzen Sie ein neues, sauberes Deckglas auf den Montagepuffer.
- Sammeln Sie die Navigationskarte.
- Suchen Sie den Schnitt mit dem gezeichneten Ring als Marker im Hellfeld-Bildgebungsmodus eines inversen Fluoreszenzmikroskops (siehe Materialtabelle). Wechseln Sie in eine Ecke des Abschnitts. Schalten Sie das weiße Licht ein und nehmen Sie das Hellfeldbild auf.
- Schalten Sie das weiße Licht aus. Schalten Sie den Laser (561 nm) ein und nehmen Sie fluoreszierende Bilder mit demselben Sichtfeld (FOV) auf.
- Schalten Sie den Laser aus. Gehen Sie zum benachbarten Sichtfeld und stellen Sie sicher, dass diese beiden Sichtfelder eine Überlappung von 10 % haben. Nehmen Sie das Hellfeldbild und das Fluoreszenzbild des zweiten FOV.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der gesamte Abschnitt bedeckt ist. Zeichnen Sie den Bildpfad auf, der zum Zusammenfügen des Sichtfelds verwendet werden kann.
HINWEIS: Für eine höhere Bildqualität empfehlen wir die Verwendung des konfokalen Mikroskops.
- Bildzellen von Interesse.
- Verwenden Sie die Navigationskarte, um interessante Zellen einfach anzuvisieren. Schalten Sie den Laser (561 nm) ein und nehmen Sie 300 Bilder mit fluoreszierenden Bildern der gewünschten Zelle auf. Schalten Sie den Laser aus.
- Schalten Sie das weiße Licht ein und nehmen Sie sequentielle Hellfeldbilder (~100 Bilder) auf.
- Wechseln Sie zu einer anderen Zelle von Interesse.
6. Vorbereitung für die EM-Bildgebung
HINWEIS: Der Arbeitsablauf ist in Abbildung 3B dargestellt.
- Übertragen Sie den ultradünnen Abschnitt auf das Schlitzraster.
- Füllen Sie ein Glas mit ddH2O.
- Nehmen Sie die Deckgläser aus der Kammer und trennen Sie die beiden Deckgläser mit einer Pinzette. Klemmen Sie das Deckglas, auf dem sich der Abschnitt befindet, ab, waschen Sie den Montagepuffer ab und trocknen Sie ihn an der Luft.
- Ritzen Sie mit einer einseitigen Klinge ein # um den ultradünnen Abschnitt und tropfen Sie 10 μl 12%ige Flusssäure (siehe Materialtabelle) an jede Ecke des #. Legen Sie das Deckglas langsam ins Wasser.
HINWEIS: Flusssäure reagiert mit Glas und erleichtert das Entfernen des Pioloformfilms vom Deckglas. Flusssäure ist giftig. Verwenden Sie es in einer chemischen Haube mit Handschuhen. Der Kontakt mit der Haut erfordert sofortige ärztliche Hilfe. - Treiben Sie den Pioloformfilm und den ultradünnen Schnitt zusammen auf der Wasseroberfläche. Legen Sie ein unbeschichtetes Schlitzraster auf den Abschnitt, um den Abschnitt in der Mitte des Rasters zu erfassen.
- Decken Sie einen Objektträger mit Parafilm ab (siehe Materialtabelle) und nehmen Sie das Gitter mit der Pioloformfolie auf. Trocknen Sie das Gitter bei Raumtemperatur an der Luft.
- Schnittfärbung
- Färben Sie den Abschnitt mit 2% UA und Satos dreifachem Vorsprung. Weitere Informationen finden Sie im zuvor veröffentlichten Protokoll2.
7. Bildanalyse
- Fügen Sie die Navigationskarte zusammen.
- Suchen Sie den Speicherort der Rohdaten. Öffnen Sie die Software ImageJ (siehe Materialtabelle), um die Navigationskarte zu stitchen.
- Klicken Sie auf Plugins | Nähte | Gitter-/Kollektionsnähte | (Typ) Gitter: Schlange nach Spalte | (Bestellung) Up & Left (je nach Aufnahmereihenfolge) | Slice-Größe festlegen | Datenpfad auswählen | Dateinamen festlegen | Aktivieren Sie die Option Displayfusion. Beobachten Sie das Ergebnis, eine Navigationskarte, die aus mehreren Hellfeldbildern mit unterschiedlichen Sichtfeldern besteht.
- Verwenden Sie die gleiche Methode, um eine Fluoreszenznavigationskarte zu stitchen.
- Führen Sie die Hellfeldbilder mit den Fluoreszenzbildern zusammen.
- Klicken Sie in der Software ImageJ auf Datei | Importieren | Bildsequenz zum Importieren der sequentiellen Hellfeldbilder der interessierenden Zelle.
- Klicken Sie auf Bild | Stapel | Z-Projektion | Summen-Slices , um das SIP-Bild (Sum Intensity Projection) der sequenziellen Hellfeldbilder zu erhalten.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Invertieren , um das SIP-Bild des Hellfelds so umzukehren, dass die Signale der Goldnanopartikel zu hellen weißen Punkten werden.
- Klicken Sie in ImageJ auf Datei | Importieren | Bildsequenz zum Importieren der sequenziellen FM-Bilder.
- Klicken Sie auf Bild | Stapel | Z-Projektion | Summen-Slices , um das SIP-Image der sequenziellen FM-Images zu erhalten.
- Klicken Sie auf Bild | Farbe | Kanäle zusammenführen , um das SIP-Hellfeldbild mit dem SIP-FM-Bild als zusammengesetztes Bild zusammenzuführen.
- Die Goldnanopartikel sind grün und das fluoreszierende Protein ist rot. Klicken Sie auf Bild | Typ | RGB-Farbe , um das Format des zusammengesetzten Bildes in RGB zu konvertieren.
8. EM-Bildgebung
- Legen Sie das Gitter auf den Probengriff, wobei Sie die Abschnittsseite des Gitters nach oben halten.
- Verwenden Sie die Navigationskarte, um die Position der entsprechenden Zellen unter einem Elektronenmikroskop durch vier relative Abstände zu den vier verschiedenen Ecken des rechten Trapezes des ultradünnen Schnitts grob zu identifizieren.
- Bestätigen Sie die Zellen mit den Goldnanopartikeln.
- Nehmen Sie EM-Bilder in verschiedenen Vergrößerungen (4.200x, 6.000x oder 8.200x) mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) auf (siehe Materialtabelle).
9. Registrierung des UKW-Bildes mit dem EM-Bild
- Öffnen Sie die Registrierungssoftware (siehe Materialtabelle). Geben Sie easyCLEMv014in das Suchfenster ein. Klicken Sie auf easyCLEMv0, um easyCLEMv0 zu öffnen. Klicken Sie auf Bild/Sequenz | Öffnen , um das EM-Bild und das zusammengesetzte Bild in das Bedienfeld der Software zu importieren.
- Klicken Sie im EasyCLEMv0-Fenster auf 2D (x,y,[T]), um nicht starr (2D oder 3D) als Ausrichtungsmodus auszuwählen.
- Klicken Sie im EasyCLEMv0-Fenster auf das Dropdown-Feld rechts neben Bild auswählen, das transformiert und in der Größe geändert werden soll (wahrscheinlich FM), um Composite (RGB)color.tif auszuwählen. Klicken Sie dann auf das Dropdown-Feld rechts neben Bild auswählen, das nicht geändert wird (wahrscheinlich EM), um EMimage. tif auszuwählen.
- Klicken Sie auf Start , um die Registrierung zu starten.
- Klicken Sie im EM-Bildfenster mit dem Namen EMimage. tif auf ein Goldnanopartikel, um Punkt 1 auf das Goldnanopartikel zu setzen. Klicken Sie im FM-Bildfenster mit dem Namen Composite (RGB)color.tif auf das entsprechende Goldnanopartikel, um Punkt 1 auf das Goldnanopartikel zu setzen.
- Klicken Sie auf Transformation aktualisieren , um das LM-Signal mit dem EM-Signal der Goldnanopartikel zu bestätigen.
- Wiederholen Sie den obigen Vorgang im EM-Bildfenster mit dem Namen EMimage. tif und gleichen Sie das LM-Signal nacheinander mit dem EM-Signal desselben Goldnanopartikels ab.
- Klicken Sie auf Stopp , um die Registrierung abzuschließen.
- Klicken Sie nach der Bildausrichtung auf Überlagertes Bild und klicken Sie auf Bild/Sequenz | Speichern unter , um einen Bildstapel mit vier Kanalbildern (Rot, Grün, Blau, Grau) zu exportieren.
- Öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Datei | Öffnen , um das überlagerte Bild zu importieren. Klicken Sie auf Bild | Stapel | Stapeln Sie in Bilder , um das überlagerte Bild in Bilder mit vier Kanälen zu unterteilen.
- Klicken Sie auf Bild | Farbe | Kanäle zusammenführen , um Bilder aus drei Kanälen (Rot, Grün und Grau) zu einem zusammengesetzten Bild zusammenzuführen.
- Klicken Sie auf Bild | Typ | RGB-Farbe , um das zusammengesetzte Bild in ein CLEM-Bild umzuwandeln.
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Representative Results
Frühere Berichte zeigten, dass mScarlet auf das Lysosom15 abzielen kann. In diesem Protokoll wurde AAV-exprimierendes mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) mit stereotaktischen Instrumenten in das M1 (ML: ±1,2 AP: +1,3 DV: -1,5) des Vglut2-ires-cre-Mausgehirns injiziert. Dem oben beschriebenen Protokoll folgend, ist das endgültige korrelierte Bild in Abbildung 4A dargestellt. Das FM-Bild kann mit Goldnanopartikeln (den grünen Punkten) als Passermarken genau an das EM-Bild angepasst werden. Wie im EM-Bild (Abbildung 4C,F) gezeigt, zielte mScarlet auf das Lysosom ab, und die Inhalte in den Lysosomen sind heterogen, was die typischen Eigenschaften des sekundären Lysosoms sind.
Abbildung 1: Schematische Übersicht der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie. (A) Präparation des Mäusegehirns. Adeno-assoziierte Viren wurden in das Mäusegehirn injiziert. Nach 30 Tagen wurden die fluoreszierenden Regionen von Mäusehirnschnitten für die EM-Probenvorbereitung in kleine Blöcke geschnitten. (B) EM-Probenvorbereitung. (C) Ultradünner Schnitt mit einem Diamantmesser und der schematischen Darstellung des Deckglases. (D) FM-Bildgebung und TEM-Bildgebung. Abkürzungen: EM = Elektronenmikroskopie; FM = Fluoreszenzmikroskopie; TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beschichtung von Deckgläsern mit Goldnanopartikeln. (A) Deckglas durch Zentrifugation mit Pioloform bedecken. (B) Inkubieren Sie die Deckglasoberfläche mit Poly-L-Lysin. (C) Inkubieren Sie die Deckglasoberfläche mit den verdünnten Goldnanopartikeln. (D) Schematische Darstellung des beschichteten Deckglases. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Der Zeitplan der Vorbereitungen für die FM-Bildgebung und die EM-Bildgebung. (A) Der Arbeitsablauf der Vorbereitungen für die FM-Bildgebung besteht aus fünf Schritten: (i) Schöpfen des ultradünnen Schnitts, (ii) Lufttrocknen, (iii) Platzieren eines zweiten Deckglases nach Zugabe des Puffers, (iv) Fixieren beider Deckgläser in der Kammer und FM-Bildgebung. (B) Der Arbeitsablauf der Vorbereitungen für die EM-Bildgebung besteht ebenfalls aus fünf Schritten: (i) Trennen der beiden Deckgläser, (ii) Aufschwimmen des ultradünnen Schnitts, (iii) Aufschöpfen des ultradünnen Schnitts, (iv) Verschieben des ultradünnen Schnitts auf das Schlitzgitter und (v) EM-Bildgebung. Abkürzungen: EM = Elektronenmikroskopie; FM = Fluoreszenzmikroskopie; TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentatives CLEM-Bild von mScarlet. (A) Das CLEM-Bild des gesamten Neurons. (B,E) Die CLEM-Bilder des Einschubs. (C,F) Die EM-Bilder des Einschubs. (D,G) Die Fluoreszenzbilder des Einschubs. Grüne Punkte zeigen Goldnanopartikel an. Maßstabsleiste = 5 μm (A), 1 μm (eingefügte Bilder). Abkürzungen: EM = Elektronenmikroskopie; FM = Fluoreszenzmikroskopie; CLEM = korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll ist ein vielseitiges bildgebendes Verfahren, das die Lokalisierungsinformationen des Zielproteins aus der Lichtmikroskopie (LM) und den Kontext um das Zielprotein aus der Elektronenmikroskopie (EM) kombinieren kann6. Aufgrund der Einschränkungen der derzeitigen fluoreszierenden Proteine ist die weit verbreitete Methode die Voreinbettung der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM), was bedeutet, dass die LM-Bildgebung vor der EM-Probenvorbereitung durchgeführt wird. Fast alle vorhandenen fluoreszierenden Proteine können in Pre-Embedding CLEM untersucht werden. Aufgrund der unvermeidlichen Verzerrungen und Schrumpfungen ist eine genaue Ausrichtung des endgültigen Bildes jedoch unmöglich6. Daher dienen die Informationen, die durch die Voreinbettung von CLEM bereitgestellt werden, dazu, die Ultrastrukturen derselben Zelle, die von LM in der EM-Bildgebung abgebildet wurden, zu überprüfen.
Die in dieser Studie vorgestellte Methode ist die Post-Embedding-CLEM, bei der die LM-Bildgebung nach der EM-Probenvorbereitung durchgeführt wird. Die durch die chemische Fixierung in der EM-Probenvorbereitung verursachte Schrumpfung hat keinen Einfluss auf die genaue Ausrichtung des endgültigen Bildes. Da sowohl die LM-Bildgebung als auch die EM-Bildgebung am selben Abschnitt und mit Hilfe von Goldnanopartikeln durchgeführt werden, kann die endgültige Bildausrichtung sehr genau sein. Die Post-Embedding-CLEM erfordert, dass die fluoreszierenden Proteine nach der herkömmlichen EM-Probenvorbereitung ein Fluoreszenzsignal beibehalten. Zuvor hatten wir über das erste fluoreszierende Protein namens mEosEM berichtet, das Fluoreszenzsignale mit Epon als Einbettungsharzspeichern kann 8. Im Vergleich zu anderen Harzen als Einbettungsharze hat Epon überlegene Ultrastrukturkonservierungs- und Schnitteigenschaften. Nach mEosEM wurden andere resistente Epon-einbettende fluoreszierende Proteine berichtet, wie mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 und HfYFP 9.
Nach unserer Erfahrung ist mScarlet anderen fluoreszierenden Proteinen überlegen. Fixierlösung kann die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine beeinflussen. Im Allgemeinen ist die Fixierungsgeschwindigkeit von Paraformaldehyd (PFA) viel langsamer als die von Glutaraldehyd (GA); umgekehrt dringt PFA schneller in die Probe ein als das größere GA. Eine Mischung aus PFA und GA bietet ein Gleichgewicht zwischen der Fixierung der Probe schnell genug, um ihre Qualität zu erhalten, aber langsam genug, dass keine Probenschäden wie Oxidation auftreten. Die höhere GA-Konzentration führt zu einer höheren Autofluoreszenz. Aus unserer Erfahrung kann die Fluoreszenz von mScarlet im Harzblock 6 Monate nach der Polymerisation nachgewiesen werden. Wir empfehlen jedoch, die CLEM-Bildgebung unmittelbar nach der Polymerisation durchzuführen.
Ein weiterer Schlüsselfaktor beim Post-Embedding von CLEM ist die genaue Registrierung des LM-Bildes mit dem EM-Bild. Basierend auf den zuvor berichteten Methoden 6,21 haben wir einige Änderungen am Protokoll vorgenommen. Die erste ist, wie man dieselbe Zelle findet, die von LM in der EM-Bildgebung abgebildet wurde. Wir haben verschiedene Sichtfelder verwendet, um die Navigationskarte des gesamten ultradünnen Abschnitts mit DIC und Fluoreszenzbildgebungsmodus zusammenzusetzen. Mit Hilfe der Navigationskarte konnten die interessierenden Zellen leicht identifiziert werden. Eine weitere Verbesserung ist die genaue Bildausrichtung. Zuvor haben wir das Fluoreszenzsignal im Fluoreszenz-Bildgebungsmodus und ein Signal mit hohem Elektronenkontrast im EM-Bildgebungsmodus der Goldnanopartikel als Passermarken-Marker6 verwendet. Bei der Verwendung von mScarlet war das Fluoreszenzsignal von mScarlet jedoch viel höher als das Fluoreszenzsignal der Goldnanopartikel und es war schwierig, das Fluoreszenzsignal von Goldnanopartikeln nachzuweisen. Um dieses Problem zu lösen, haben wir anstelle des Fluoreszenzsignals das Hellfeldsignal der Goldnanopartikel zur Registrierung verwendet. Nach diesem modifizierten Protokoll war es einfach, CLEM nach der Einbettung durchzuführen.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen des aktuellen Protokolls, die vor der Verwendung berücksichtigt werden sollten. Obwohl es im Überexpressionssystem gut funktioniert, ist die Fluoreszenz ziemlich schwach, wenn sich die Zielproteine unter ihrem nativen Promotor22 befinden. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass, obwohl mScarlet (nach unserer Erfahrung) das beste fluoreszierende Protein ist, das nach der EM-Probenvorbereitung genügend Fluoreszenzsignale speichern kann und in Säugetierzellen gut funktioniert, es ein Problem darstellt, wenn mScarlet als Fluoreszenzmarkierung in Neuronen verwendet wird, was zu einer falschen Position der Zielproteine führen kann15. In diesen Fällen empfehlen wir die Verwendung von oScarlet15, einer Mutation von mScarlet, die in Neuronen gut funktioniert.
Die Anwendungsmöglichkeiten dieses modifizierten Protokolls lassen sich in zwei Kategorien einteilen. Die erste besteht darin, in die subzelluläre Ebene zu zoomen, was bedeutet, dass das Zielprotein im subzellulären Kontext untersucht wird. In unseren zuvor veröffentlichten Berichten haben wir CLEM nach der Einbettung verwendet, um die Bildung von zytoplasmatischen Virion-Assemblierungskompartimenten (cVACs) während einer Infektion mit einem γ-Herpesviruszu untersuchen 23. In zukünftigen Anwendungen kann die Post-Embedding-CLEM mit der Elektronentomographie kombiniert werden, um die 3D-Verteilung der Zielproteine zu erhalten und die 3D-Struktur nativzu lösen 24. Die zweite Art potenzieller Anwendung besteht darin, auf die zelluläre Ebene herauszuzoomen, mit der neuronale Schaltkreise gezeichnet und analysiert werden können. Aufgrund ihrer hohen Auflösungsfähigkeit ist EM zu einem effektiven Mittel zur Kartierung feiner Hirnverbindungen geworden. EM kann jedoch die Identität von Neuronen nicht genau angeben, was die eingehende Analyse des neuronalen Schaltkreises einschränkt. Epon Post-Embedding CLEM hat das Potenzial, die Identitäten von Neuronen in den neuronalen Schaltkreis zu bringen, ohne die Ultrastrukturen zu beeinträchtigen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (32201235 zu Zhifei Fu), der Natural Science Foundation der Provinz Fujian, China (2022J01287 zu Zhifei Fu), der Research Foundation for Advanced Talents an der Fujian Medical University, China (XRCZX2021013 zu Zhifei Fu), der Finance Special Science Foundation der Provinz Fujian, China (22SCZZX002 zu Zhifei Fu), Gründung des NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-Human Primate und des Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 an Zhifei Fu). Wir danken Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin und Yan Hu vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für die Unterstützung bei der EM-Probenvorbereitung und EM-Bildgebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
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