Summary
mScarletと呼ばれる蛍光タンパク質を使用したEponの埋め込み後相関光および電子顕微鏡の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、蛍光と超微細構造を同時に維持できます。この技術は、さまざまな生物学的用途に適しています。
Abstract
光電子相関顕微鏡(CLEM)は、蛍光顕微鏡(FM)によって得られる局在情報と、電子顕微鏡(EM)によって取得された細胞の微細構造のコンテキストを組み合わせた包括的な顕微鏡です。CLEMは蛍光と超微細構造のトレードオフであり、通常、超微細構造は蛍光を損ないます。メタクリル酸グリシジル、HM20、K4Mなどの他の親水性包埋樹脂と比較して、エポンは超微細構造の保存と切断特性に優れています。以前、mEosEMが四酸化オスミウムの固定とエポンの包埋に耐えられることを実証しました。mEosEMを用いて、蛍光と超微細構造を同時に維持するEpon post embedd CLEMを世界で初めて実現しました。ここでは、EMサンプルの調製、FMイメージング、EMイメージング、および画像アライメントについて、ステップバイステップで詳しく説明します。また、EMイメージング中にFMイメージングで画像化された同じ細胞を識別する手順を改善し、FM画像とEM画像間のレジストレーションを詳細に説明します。私たちは、従来のEM施設でこの新しいプロトコルに従って、Epon post埋め込み相関光および電子顕微鏡を簡単に実現できると信じています。
Introduction
蛍光顕微鏡(FM)を使用して、標的タンパク質の局在と分布を得ることができます。しかし、標的タンパク質を取り巻くコンテキストが失われているため、標的タンパク質を徹底的に調べるためには非常に重要です。電子顕微鏡(EM)は、イメージング分解能が最も高く、細胞内の詳細をいくつか提供します。それにもかかわらず、EMにはターゲットラベリングがありません。FMで撮影した蛍光画像とEMで取得した灰色画像を正確に合成することにより、相関光電子顕微鏡(CLEM)は、これら2つのイメージングモード1,2,3,4で得られた情報を組み合わせることができます。
CLEMは、蛍光と超微細構造1のトレードオフである。現在の蛍光タンパク質と従来のEMサンプル調製手順、特にオスミン酸(OsO4)やEponなどの疎水性樹脂の使用には限界があるため、超微細構造は常に蛍光を損ないます5。OsO4 は、EM画像のコントラストを改善するために使用されるEMサンプル調製に不可欠な試薬です。他の包埋樹脂と比較して、エポンは超微細構造の保存と切断特性に優れています5。しかし、OsO4 およびEpon embedding6の処理後に蛍光シグナルを保持できる蛍光タンパク質はありません。蛍光タンパク質の限界を克服するために、EMサンプル調製の前にFMイメージングを行うプレエンベディングCLEMが開発されました6。しかし、CLEMを事前に埋め込むことの欠点は、FM画像とEM画像の間のレジストレーションが不正確である5。
それどころか、ポストエンベディングCLEM法は、EMサンプル調製後にFMイメージングを行い、その登録精度は6〜7nmに達する可能性があります5,6。蛍光タンパク質の蛍光を保持するために、超低濃度のOsO4(0.001%)3または高圧凍結(HPF)および凍結置換(FS)EM調製法4,7が使用されてきましたが、微細構造の損傷やEM画像のコントラストが犠牲になっています。mEos4bの開発は、包埋樹脂としてグリシジルメタクリレートが用いられているが、ポスト包埋型CLEMの進行を大きく促進する5。OsO4染色とエポン包埋に耐えられるmEosEMの開発により、蛍光と超微細構造を同時に維持するエポンポスト包埋超解像CLEMが初めて達成されました6。mEosEMの後、OsO4染色とEpon包埋に耐えられるいくつかの蛍光タンパク質が開発されました8,9,10,11。これにより、CLEMの開発が大幅に促進されます。
EponのポストエンベデッドCLEMには3つの重要な側面があります。1つ目は蛍光タンパク質で、EMサンプル調製後も蛍光シグナルを維持する必要があります。私たちの経験によると、mScarletは他の報告された蛍光タンパク質よりも優れています。2つ目は、FMイメージングで撮像した同じ細胞をEMイメージングで見つける方法です。この問題を解決するために、このステップの手順を改善して、目的の細胞を簡単に見つけられるようにします。最後は、FM画像とEM画像を合わせる方法です。ここでは、FM画像とEM画像間のレジストレーションについて詳しく説明します。このプロトコルでは、VGLUT2ニューロンでmScarletを発現し、mScarletがEponポスト埋め込みCLEMを使用して二次リソソームを標的にできることを実証します。エポンの埋め込み後CLEMについて、蛍光と超微細構造を損なうことなく、段階的に詳しく説明します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物の飼育と実験は、福建医科大学医療センターの施設動物管理および使用委員会によって承認されました。現在のプロトコルのステップバイステップのワークフローを 図1に示します。
1. サンプル調製
- マウス脳
- トランスジェニックマウス( 材料表を参照)およびオリゴヌクレオチドプライマー( 材料表を参照)を購入して、これらのマウスを遺伝子型決定します。
- 以前に公開されたプロトコル12,13に従って、無傷の脳を頭蓋ボールトから灌流して除去します。
- 10 mLの固定液( 材料表を参照)を用いて、4°Cで一晩マウスの脳を固定します。
- 固定液を0.1 Mリン酸緩衝液(PB)で3 x 10分間洗い流します。
- 振動するミクロトームを用いて、マウスの脳を厚さ500μmの切片にスライスします( 材料表を参照)。
- 実体顕微鏡を用いてメスで蛍光領域を小さな塊に切断する( 材料表参照)。
注意: 小さなブロックの体積は1mm3を超えてはなりません。
- 培養細胞
- HeLa細胞を6cmの細胞培養皿に播種し、増殖培地(10%ウシ胎児血清[FBS]を添加したダルベッコの改変イーグル培地[DMEM]低グルコース)で維持します。
- 翌日、トランスフェクションキットの取扱説明書に従って、DNAトランスフェクション試薬( 材料表参照)を使用して、mScarletを含むプラスミドを細胞にトランスフェクションします。
- トランスフェクションの48時間後に、トランスフェクションした細胞をトリプシン処理し、遠心分離して1,000 × gの細胞ペレットを得ます。細胞ペレットは サンプルブロックと呼ばれます。
2. EMサンプル調製
- 固定
- 固定液( 材料表を参照)を使用して、4°Cで一晩サンプルブロックを固定します。
- 固定液を除去し、サンプルブロックから0.1 M PBで3 x 10分間、固定液を洗い流します。
- 四酸化オスミウム(OsO4)染色
- サンプルブロックをOsO4 溶液( 材料表を参照)で4°Cで1時間固定します。
- OsO4溶液を除去し、サンプルブロックからddH2OでOsO4溶液を3 x 10分間洗い流します。
- 酢酸ウラニル(UA)染色
- 2% UA溶液( 材料表を参照)を使用して、4°Cで1時間サンプルブロックを染色します。
- UA溶液を除去し、サンプルブロックをddH2Oで3 x 10分間すすぎます。
- グラジエント脱水
- グラジエントエタノールでサンプルブロックを脱水するには、50%で10分、70%で10分、80%で10分、90%で10分、100%エタノールで2回。
- サンプルブロックを無水アセトンで3 x 10分間脱水します。
- 樹脂の浸透
- アセトンと樹脂を3:1で1時間、アセトンと樹脂を1:1で2時間、アセトンと樹脂を1:3で3時間、グラジエント樹脂をサンプルブロックに浸透させます( 材料表を参照)。
- 純粋な樹脂と交換して3 x 12時間。
- 樹脂包埋
- つまようじを使用してサンプルブロックをカプセル( 材料表を参照)に移します。
- サンプルブロックの入ったカプセルに純粋な樹脂を添加し、60°Cのオーブンで14〜16時間重合します。
3. カバーガラスの金ナノ粒子によるコーティング
- カバーガラスのクリーニング
- カバーグラスをクリーニングバッファー( 材料表を参照)で142°Cで2時間洗浄します。
- 洗浄バッファーをddH2Oで3 x 10分間洗い流します。
- カバーグラスを無水エチルアルコールを含むビーカーに慎重に移し、一晩インキュベートします。
- カバーグラスをクリーンベンチで数分間風乾します。
- カバーガラスを金ナノ粒子でコーティングします。
- ガラスセメントを使用して、卓上遠心分離機( 材料表を参照)の回転の中心にスライドガラスを固定します。
- スライドガラスの中央に付箋を使用してカバーガラスを取り付けます。
- カバーガラスに1%ピオロホルム( 材料表を参照)75 μLを加えます。
注:Formvar( 材料表を参照)もテストしましたが、正常に機能します。 - 1,360 × g (図2A)で3分間スピンし、カバーガラスの表面にピオロホルムの薄層を生成します。
- カバーガラス表面を 250 μL の 0.1% ポリ-L-リジン( 材料表を参照)と室温で 1 時間インキュベートします(図 2B)。
- ddH2Oですすぎ、カバーガラスを数分間風乾させます。
- 80 nmの金ナノ粒子( 材料表を参照)をddH2Oで25%(v/v、OD600 = 0.07)( 材料表を参照)に希釈し、15分間超音波処理します。
- カバーガラス表面を希釈した金ナノ粒子と室温で1時間インキュベートします(図2C)。
- ddH2Oですすぎ、カバーガラスを数分間風乾させます。
注:ピオロホルムと金ナノ粒子でコーティングしてから2週間後にうまく機能します。ただし、コーティング後はすぐに使用することをお勧めします。
4. 極薄切片化
- サンプルブロックの表面を直角の台形にトリミングします。ダイヤモンドナイフ( 材料表参照)とウルトラミクロトーム( 材料表参照)を使用して、厚さ100 nmで切片を切断します。セクションバンドから単一のセクションを分離し、単一のセクションをウォーターバスに浮かべます。
- 金ナノ粒子でコーティングされたカバーガラスの中央にddH2Oを滴下します。サンプルループを使用してセクションを拾い上げ、サンプルループを水滴の表面に反転させます。サンプルループを取り外し、水滴の表面にセクションを残します。
- カバーガラスを数分間風乾します。マーカーペンを使用して、カバーガラスの反対側のセクションの周りに円環を描きます。
5. 光学顕微鏡イメージング
- 蛍光回収
メモ: ワークフローを 図 3A に示します。- カバーガラスの極薄部分に10 μLの封入バッファー( 材料表を参照)を加えます。新しい清潔なカバーガラスを取り付けバッファーに置きます。
注:封入バッファーの主要成分は、蛍光タンパク質の蛍光を回収するために使用される DABCO です。これは蛍光回復にとって非常に重要です。 - これら2つのカバーガラスを極薄切片と一緒にイメージングチャンバーに入れます( 材料表を参照)。描かれた環状のカバーガラスが上部にあることを確認してください。
- カバーガラスの極薄部分に10 μLの封入バッファー( 材料表を参照)を加えます。新しい清潔なカバーガラスを取り付けバッファーに置きます。
- ナビゲーション マップを収集します。
- 倒立蛍光顕微鏡の 明視野イメージングモードで 、描画した環状をマーカーとして使用して切片を見つけます( 材料表を参照)。セクションの 1 つのコーナーに移動します。白色光をオンにして、 明視野画像を撮影します。
- 白色光を消します。レーザー(561 nm)をオンにして、同じ視野(FOV)の蛍光画像を撮影します。
- レーザーをオフにします。隣接する FOV に移動し、これら 2 つの FOV が 10% 重なっていることを確認します。2番目のFOVの明視野画像と蛍光画像を撮影します。
- セクション全体が覆われるまで、この操作を繰り返します。FOVのステッチに使用できるイメージングパスを記録します。
注:画像の品質を高めるには、共焦点顕微鏡の使用をお勧めします。
- 関心のある画像セル。
- ナビゲーション マップを使用して、関心のあるセルを簡単にターゲットにすることができます。レーザー(561 nm)をオンにして、目的の細胞の蛍光画像を300フレーム撮影します。レーザーをオフにします。
- 白色光をオンにして、連続した明視野画像(~100フレーム)を撮影します。
- 目的の別のセルに移動します。
6. EMイメージングの準備
メモ: ワークフローを 図3Bに示します。
- 極薄断面をスロットグリッドに移します。
- ガラス瓶にddH2Oを入れます。
- カバーグラスをチャンバーから取り外し、ピンセットで2つのカバーグラスを分離します。クランプ セクションが配置されているカバーガラス、取り付けバッファーを洗い流し、風乾します。
- 片面ブレードを使用して極薄切片の周囲に#に切り込みを入れ、#の各コーナーに10μLの12%フッ化水素酸(材料表を参照)を滴下します。カバーガラスをゆっくりと水に入れます。
注意: フッ化水素酸はガラスと反応するため、カバーガラスからピオロホルムフィルムを簡単に取り除くことができます。フッ化水素酸は有毒です。ケミカルフードに入れて手袋をして使用してください。皮膚との接触には、直ちに医師の診察が必要です。 - ピオロホルム膜と極薄切片を一緒に水面に浮かべます。セクションにコーティングされていないスロットグリッドを配置して、グリッドの中央にあるセクションをキャプチャします。
- スライドガラスをパラフィルムで覆い( 材料表を参照)、ピオロホルムフィルムでグリッドをピックアップします。グリッドを室温で風乾します。
- 切片染色
- UA2%と佐藤のトリプルリードでセクションを汚す。詳細については、以前に公開されたプロトコル2 を参照してください。
7. 画像解析
- ナビゲーションマップをステッチします。
- 生データの場所を見つけます。ソフトウェアImageJ( 材料表を参照)を開き、ナビゲーションマップをステッチします。
- [ プラグイン] |ステッチ |グリッド/コレクションステッチ |(タイプ)グリッド: 列による蛇 |(注文)上と左 (撮影シーケンスによる) |スライス サイズを設定する |データパスの選択 |ファイル名の設定 |[ディスプレイの融合] をオンにします。異なる FOV の複数の明視野画像で構成されるナビゲーション マップの結果を観察します。
- 同じ方法を使用して、蛍光ナビゲーションマップをステッチします。
- 明視野画像と蛍光画像をマージします。
- ソフトウェア ImageJ で、[ ファイル] |インポート |画像シーケンス は、関心のあるセルの連続した明視野画像をインポートします。
- 画像をクリック |スタック |Z プロジェクション |Sum Slices は、シーケンシャル明視野イメージの総強度投影 (SIP) イメージを取得します。
- [ 編集] |反転 は、明視野のSIP像を反転させ、金ナノ粒子の信号が明るい白い点になるようにします。
- ImageJ で、[ ファイル] |インポート |シー ケンシャルFM画像をインポートするための画像シーケンス。
- 画像をクリック |スタック |Z プロジェクション |Sum Slices を使用して、シーケンシャル FM イメージの SIP イメージを取得します。
- 画像をクリック |カラー |[チャンネルのマージ(Merge Channels )] は、SIP 明視野画像と SIP FM イメージを合成画像としてマージします。
- 金ナノ粒子は緑色で、蛍光タンパク質は赤色です。画像をクリック |種類 |「RGB カラー 」を選択すると、合成画像の形式が RGB に変換されます。
8. EMイメージング
- グリッドをサンプルホールドに置き、グリッドの断面側を上に保ちます。
- ナビゲーションマップを使用して、極薄切片の右台形の4つの異なる角までの4つの異なる角までの4つの相対距離を通じて、電子顕微鏡下で対応する細胞の位置を大まかに特定します。
- 金ナノ粒子を用いて細胞を確認します。
- 透過型電子顕微鏡(TEM)で異なる倍率(4,200倍、6,000倍、8,200倍)でEM画像を撮影します( 材料表参照)。
9. FM画像とEM画像の登録
- 登録ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。検索ウィンドウに 「easyCLEMv014」と入力します。easyCLEMv0 をクリックして easyCLEMv0 を開きます。 [画像/シーケンス] |EM 画像と合成画像をソフトウェアのパネルにインポートします。
- EasyCLEMv0ウィンドウで、2D(x,y,[T])をクリックし、アライメントモードとして非剛体(2Dまたは3D)を選択します。
- [EasyCLEMv0] ウィンドウで、[ Select image that will be transformed and resize (おそらく FM)] の右側にあるドロップダウン ボックスをクリックして、[ Composite (RGB)color.tif を選択します。次に、[ 変更されない画像を選択(おそらくEM)]の 右側にあるドロップダウンボックスをクリックして、 EMimage. tifを選択します。
- [開始]をクリックして登録を開始します。
- EMimage. tifという名前のEM画像ウィンドウで、1つの金ナノ粒子をクリックして、ポイント1を金ナノ粒子の上に置きます。Composite (RGB)color.tif という名前の FM 画像ウィンドウで、対応する金ナノ粒子をクリックして、ポイント 1 を金ナノ粒子に配置します。
- Update Transformationをクリックして、金ナノ粒子のEMシグナルでLMシグナルを確認します。
- EMimage. tifという名前のEM画像ウィンドウで上記の操作を繰り返し、LM信号を同じ金ナノ粒子のEM信号と1つずつ一致させます。
- [ 停止 ]をクリックして登録を完了します。
- 画像の位置合わせ後、 オーバーレイ 画像をクリックし、 画像/シーケンス |名前を付けて保存 は、4 つのチャンネル画像(赤、緑、青、グレー)を含む画像スタックを書き出します。
- ImageJ を開き、[ ファイル] |[開く ] をクリックして、オーバーレイ画像をインポート します 。画像をクリック |スタック |「画像にスタック 」は、 オーバーレイされた 画像を 4 つのチャンネル画像に分割します。
- 画像をクリック |カラー |「チャンネルを結合 」は、3 つのチャンネル(赤、緑、グレー)の画像を合成画像に結合します。
- 画像をクリック |種類 |「RGB カラー 」を選択すると、合成画像が CLEM 画像に変換されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以前の報告では、mScarletがリソソーム15を標的にできることが実証されました。このプロトコルでは、mScarlet(rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA)を発現するAAVを、Vglut2-ires-creマウス脳のM1(ML:±1.2 AP:+1.3 DV:-1.5)に定位固定装置を使用して注入しました。上述したプロトコルに従って、最終的な相関画像を図4Aに示す。FM画像は、金ナノ粒子(緑色の点)を基準マーカーとして使用して、EM画像と正確に位置合わせすることができます。EM画像(図4C、F)に示すように、mScarletはリソソームを標的としており、リソソーム内部の内容物は不均一であり、これが二次リソソームの典型的な特徴です。
図1:光学顕微鏡と電子顕微鏡の相関顕微鏡の概略図。 (A)マウスの脳の準備。アデノ随伴ウイルスをマウスの脳に注射した。30日後、マウスの脳切片の蛍光領域を小さなブロックに切断し、EMサンプルを調製しました。(B)EMサンプル調製。(C)ダイヤモンドナイフを用いた極薄切片及びカバーガラスの概略図。(D)FMイメージングとTEMイメージング。略語:EM =電子顕微鏡法;FM = 蛍光顕微鏡;TEM = 透過型電子顕微鏡。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:カバーガラスを金ナノ粒子でコーティング 。 (A)遠心分離によりカバーガラスをピオロホルムで覆います。(B)カバーガラス表面をポリ-L-リジンでインキュベートします。(C)カバーガラス表面を希釈した金ナノ粒子とインキュベートします。(d)被覆カバーガラスの模式図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:FM撮像とEM撮像の準備スケジュール。 (A)FMイメージングの準備のワークフローは、(i)極薄切片のすくい取り、(ii)自然乾燥、(iii)バッファーを添加した後の2枚目のカバーガラスの配置、(iv)両方のカバーガラスをチャンバー内に固定し、FMイメージングの5つのステップで構成されています。(B)EMイメージングの準備も、(i)2枚のカバーガラスを分離する、(ii)極薄部を浮かせる、(iii)極薄部をすくい上げる、(iv)極薄部をスロットグリッドに移動させる、(v)EMイメージングを行う、の5つのステップで構成されています。略語:EM =電子顕微鏡法;FM = 蛍光顕微鏡;TEM = 透過型電子顕微鏡。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:mScarletの代表的なCLEM画像。 (A)ニューロン全体のCLEM画像。(B、E)インセットの CLEM 画像。(C、F)インセットのEM画像。(D、G)挿入図の蛍光画像。緑色の点は金ナノ粒子を示します。スケールバー = 5 μm (A)、1 μm (挿入画像)。略語:EM =電子顕微鏡法;FM = 蛍光顕微鏡;CLEM = 相関光学および電子顕微鏡法。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで紹介するプロトコールは、光学顕微鏡(LM)からの標的タンパク質の局在情報と、電子顕微鏡(EM)からの標的タンパク質を取り巻く状況を組み合わせることができる汎用性の高いイメージング方法です6。現在の蛍光タンパク質には限界があるため、広く使用されている方法は、EMサンプル調製の前にLMイメージングが行われることを意味する、相関光電子顕微鏡(CLEM)の事前埋め込みです。ほとんどすべての既存の蛍光タンパク質は、プレエンベディングCLEMで検査することができます。しかし、歪みや収縮は避けられないため、最終的な画像の正確な位置合わせは不可能です6。したがって、CLEMを事前に埋め込むことによって得られる情報は、EMイメージングでLMによって画像化された同じ細胞の超微細構造を確認することです。
この研究で提供された方法は、EMサンプル調製後にLMイメージングが行われるポストエンベディングCLEMです。EMサンプル調製における化学的固定によって引き起こされる収縮は、最終画像の正確なアライメントに影響を与えません。さらに、LMイメージングとEMイメージングの両方が同じ断面で金ナノ粒子の助けを借りて行われるため、最終的な画像アライメントは非常に正確になります。包埋後のCLEMでは、従来のEMサンプル調製後に蛍光タンパク質が蛍光シグナルを保持する必要があります。以前、我々は、包埋樹脂としてエポンを用いて蛍光シグナルを保持できるmEosEMと呼ばれる最初の蛍光タンパク質を報告した8。包埋樹脂として他の樹脂と比較して、エポンは優れた超微細構造の保存と切断特性を備えています。mEosEMに続いて、mKate211,16、mCherry210,17、mWasabi10,18、CoGFPv010,19、mEosEM-E8、mScarlet 8,20、mScarlet-I 8,20、mScarlet-H 8,20、HfYFP9などの耐性Epon包埋蛍光タンパク質が報告されています。
私たちの経験によると、mScarletは他の蛍光タンパク質よりも優れています。固定液は、蛍光タンパク質の蛍光に影響を与える可能性があります。一般に、パラホルムアルデヒド(PFA)の固定進行速度は、グルタルアルデヒド(GA)の固定速度よりもはるかに遅いです。逆に、PFAは大型のGAよりも早くサンプルに浸透します。PFAとGAの混合物は、サンプルの品質が維持されるのに十分な速さで固定し、酸化などのサンプルの損傷が発生しないほどゆっくりと固定することのバランスを提供します。GA濃度が高いほど、自家蛍光が高くなります。私たちの経験から、樹脂ブロック中のmScarletの蛍光は、重合後6ヶ月で検出できます。ただし、重合後すぐにCLEMイメージングを行うことをお勧めします。
ポストエンベデッドCLEMのもう一つの重要な要素は、LM画像とEM画像を正確にレジストレーションする方法です。以前に報告された方法6,21に基づいて、プロトコルにいくつかの変更を加えました。1つ目は、LMで撮影した同じ細胞をEMイメージングで見つける方法です。DICと蛍光イメージングモードを使用して、超薄型セクション全体のナビゲーションマップをつなぎ合わせるために、さまざまなFOVを使用しました。ナビゲーションマップを使用すると、関心のあるセルを簡単に識別できます。もう一つの改善点は、正確な画像アライメントです。従来は、金ナノ粒子の蛍光イメージングモードでの蛍光シグナルとEMイメージングモードでの高電子コントラストシグナルを基準配向マーカー6として用いていた。しかし、mScarletを用いた場合、mScarletの蛍光シグナルは金ナノ粒子の蛍光シグナルよりもはるかに高く、金ナノ粒子の蛍光シグナルを検出することは困難であった。この問題を解決するために、蛍光シグナルの代わりに金ナノ粒子の明視野シグナルをレジストレーションに使用しました。この修正されたプロトコルに従うと、埋め込み後の CLEM を簡単に実行できました。
ただし、現在のプロトコルにはいくつかの制限があり、使用する前に考慮する必要があります。過剰発現系では良好に機能するが、標的タンパク質が天然プロモーターの下にある場合、蛍光は非常に微弱である22。もう1つの制限は、mScarletはEMサンプル調製後に十分な蛍光シグナルを保持でき、哺乳類細胞で良好に機能する最良の蛍光タンパク質(我々の経験による)であるが、mScarletをニューロンの蛍光タグとして使用する場合に問題となり、標的タンパク質の位置を誤る可能性があることである15。このような場合は、ニューロンでよく機能するmScarletの変異であるoScarlet15を使用することをお勧めします。
この修正プロトコルの潜在的なアプリケーションは、2つのカテゴリに分類できます。1つ目は、細胞内レベルにズームインすること、つまり細胞内環境で標的タンパク質を研究することです。以前に発表したレポートでは、包埋後のCLEMを使用して、γヘルペスウイルス23による感染中の細胞質ウイルス粒子集合コンパートメント(cVAC)の形成を調べました。将来のアプリケーションでは、包埋後のCLEMを電子線トモグラフィーと組み合わせて、標的タンパク質の3D分布を取得し、3D構造をネイティブに解くことができます24。2つ目の応用例としては、細胞レベルまでズームアウトし、神経回路の描画や解析に活用できるものがあります。EMは、その高解像度機能により、脳の微細な接続をマッピングする効果的な手段となっています。しかし、EMはニューロンの正体を正確に提供することができないため、ニューロン回路の詳細な分析には限界があります。エポンのポストエンベディングCLEMは、超微細構造を損なうことなく、ニューロンのアイデンティティをニューロン回路にもたらす可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、中国国家自然科学基金会(Zhifei Fu 32201235)、中国福建省自然科学基金会(2022J01287 to Zhifei Fu)、福建医科大学先端人材研究財団(Zhifei Fu XRCZX2021013)、中国福建省金融特別科学基金会(22SCZZX002 to Zhifei Fu)、 NHC重点実験室、非ヒト霊長類の生殖能力調節技術評価、福建省母子保健病院(2022-NHP-04からZhifei Fu)の設立。福建医科大学公共技術サービスセンターのLinying Zhou氏、Minxia Wu氏、Xi Lin氏、Yan Hu氏には、EMサンプル調製とEMイメージングのサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
