Summary
Presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding di Epon utilizzando una proteina fluorescente chiamata mScarlet. Questo metodo può mantenere contemporaneamente la fluorescenza e l'ultrastruttura. Questa tecnica è suscettibile di un'ampia varietà di applicazioni biologiche.
Abstract
La microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM) è una microscopia completa che combina le informazioni di localizzazione fornite dalla microscopia a fluorescenza (FM) e il contesto dell'ultrastruttura cellulare acquisita dalla microscopia elettronica (EM). CLEM è un compromesso tra fluorescenza e ultrastruttura e, di solito, l'ultrastruttura compromette la fluorescenza. Rispetto ad altre resine di inclusione idrofile, come il glicidil metacrilato, HM20 o K4M, Epon è superiore nella conservazione dell'ultrastruttura e nelle proprietà di sezionamento. In precedenza, avevamo dimostrato che mEosEM può sopravvivere alla fissazione del tetrossido di osmio e all'inclusione di epon. Utilizzando mEosEM, abbiamo ottenuto, per la prima volta, Epon post embedding CLEM, che mantiene la fluorescenza e l'ultrastruttura contemporaneamente. Qui, forniamo dettagli dettagliati sulla preparazione del campione EM, l'imaging FM, l'imaging EM e l'allineamento dell'immagine. Miglioriamo anche le procedure per identificare la stessa cellula immaginata dall'imaging FM durante l'imaging EM e dettagliamo la registrazione tra le immagini FM e EM. Riteniamo che si possa facilmente ottenere la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding Epon seguendo questo nuovo protocollo nelle strutture EM tradizionali.
Introduction
La microscopia a fluorescenza (FM) può essere utilizzata per ottenere la localizzazione e la distribuzione della proteina bersaglio. Tuttavia, il contesto che circonda la proteina bersaglio viene perso, il che è fondamentale per studiare a fondo la proteina bersaglio. La microscopia elettronica (EM) ha la più alta risoluzione di imaging, fornendo diversi dettagli subcellulari. Ciononostante, i mercati emergenti non dispongono di un'etichettatura target. Unendo accuratamente l'immagine di fluorescenza acquisita da FM con l'immagine grigia acquisita da EM, la microscopia elettronica e di luce correlativa (CLEM) può combinare le informazioni ottenute da queste due modalità di imaging 1,2,3,4.
CLEM è un compromesso tra la fluorescenza e l'ultrastruttura1. A causa dei limiti delle attuali proteine fluorescenti e delle tradizionali procedure di preparazione dei campioni EM, in particolare l'uso di acido osmico (OsO4) e resine idrofobiche come Epon, l'ultrastruttura compromette sempre la fluorescenza5. OsO4 è un reagente indispensabile nella preparazione dei campioni EM, che viene utilizzato per migliorare il contrasto delle immagini EM. Rispetto ad altre resine per inclusione, Epon è superiore nella conservazione dell'ultrastruttura e nelle proprietà di sezionamento5. Tuttavia, nessuna proteina fluorescente può mantenere il segnale di fluorescenza dopo il trattamento di OsO4 e Eponembedding 6. Per superare i limiti delle proteine fluorescenti, è stato sviluppato il CLEM pre-embedding, in cui l'imaging FM viene eseguito prima della preparazione del campione EM6. Tuttavia, lo svantaggio del pre-embedding CLEM è la registrazione imprecisa tra le immagini FM e EM5.
Al contrario, il metodo CLEM post embedding esegue l'imaging FM dopo la preparazione del campione EM, la cui precisione di registrazione può raggiungere 6-7 nm 5,6. Per mantenere la fluorescenza delle proteine fluorescenti, sono state utilizzate concentrazioni molto basse di OsO4 (0,001%)3 o i metodi di preparazione EM 4,7 congelati ad alta pressione (HPF) e sostitutivi del congelamento (FS)a scapito dell'ultrastruttura compromessa o del contrasto dell'immagine EM. Lo sviluppo di mEos4b promuove notevolmente il progresso del CLEM post-embedding, sebbene il glicidil metacrilato sia utilizzato come resina di inclusione5. Con lo sviluppo di mEosEM, che può sopravvivere alla colorazione di OsO4 e all'inclusione di Epon, è stato raggiunto per la prima volta il CLEM a super-risoluzione post-inclusione di Epon, mantenendo la fluorescenza e l'ultrastruttura contemporaneamente6. Dopo mEosEM, sono state sviluppate diverse proteine fluorescenti in grado di sopravvivere alla colorazione di OsO4 e all'inclusione di Epon 8,9,10,11. Questo favorisce notevolmente lo sviluppo di CLEM.
Ci sono tre aspetti chiave per Epon post-embedding CLEM. La prima è la proteina fluorescente, che dovrebbe mantenere il segnale fluorescente dopo la preparazione del campione EM. Secondo la nostra esperienza, mScarlet è superiore ad altre proteine fluorescenti riportate. Il secondo è come trovare la stessa cellula visualizzata dall'imaging FM nell'imaging EM. Per risolvere questo problema, miglioriamo la procedura per questo passaggio in modo che si possa trovare facilmente la cellula bersaglio. L'ultimo è il metodo per allineare l'immagine FM con l'immagine EM. Qui, descriviamo in dettaglio la registrazione tra le immagini FM e EM. In questo protocollo, esprimiamo mScarlet nei neuroni VGLUT2 e dimostriamo che mScarlet può colpire i lisosomi secondari utilizzando Epon post-embedding CLEM. Forniamo dettagli passo-passo per il CLEM post-inclusione di Epon, senza compromettere la fluorescenza e l'ultrastruttura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L'allevamento e gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Fujian Medical University Medical Center. Il flusso di lavoro dettagliato del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.
1. Preparazione del campione
- Cervello di topo
- Acquistare topi transgenici (vedi Tabella dei materiali) e primer oligonucleotidici (vedi Tabella dei materiali) per genotipizzare questi topi.
- Perfondere e rimuovere il cervello intatto dalla volta cranica seguendo il protocollo12,13 precedentemente pubblicato.
- Fissare il cervello del topo utilizzando 10 mL di soluzione fissativa (vedere la tabella dei materiali) a 4 °C per una notte.
- Risciacquare la soluzione fissativa per 3 x 10 minuti con tampone fosfato 0,1 M (PB).
- Tagliare il cervello del topo in sezioni con uno spessore di 500 μm utilizzando un microtomo oscillante (vedi Tabella dei materiali).
- Tagliare le regioni fluorescenti in piccoli blocchi con un bisturi utilizzando uno stereomicroscopio (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Il volume dei blocchetti non deve essere superiore a 1 mm3.
- Cellule in coltura
- Seminare le cellule HeLa in piastre di coltura cellulare di 6 cm e mantenerle in terreno di crescita (Dulbecco's modified Eagle medium [DMEM] a basso contenuto di glucosio, integrato con il 10% di siero fetale bovino [FBS]).
- Il giorno seguente, trasfettare i plasmidi contenenti mScarlet nelle cellule utilizzando il reagente di trasfezione del DNA (vedi Tabella dei materiali) seguendo il manuale di istruzioni del kit di trasfezione.
- Quarantotto ore dopo la trasfezione, tripsinizzare le cellule trasfettate e centrifugarle per ottenere pellet cellulari a 1.000 × g. I pellet cellulari sono chiamati blocchi campione.
2. Preparazione del campione EM
- Fissazione
- Fissare i blocchi campione con una soluzione fissativa (vedi Tabella dei materiali) a 4 °C per una notte.
- Rimuovere la soluzione fissativa e risciacquare la soluzione fissativa per 3 x 10 minuti con 0,1 M PB dai blocchi di campioni.
- Colorazione con tetrossido di osmio (OsO4 )
- Fissare i blocchi di campioni con la soluzione di OsO4 (vedi tabella dei materiali) a 4 °C per 1 ora.
- Rimuovere la soluzione di OsO4 e risciacquare la soluzione di OsO4 3 x 10 minuti con ddH2O dai blocchi di campioni.
- Colorazione con acetato di uranile (UA)
- Colorare i blocchi di campioni con una soluzione di UA al 2% (vedi Tabella dei materiali) a 4 °C per 1 h.
- Rimuovere la soluzione UA e sciacquare i blocchi di campioni con ddH2O per 3 x 10 min.
- Disidratazione a gradiente
- Disidratare i blocchi di campioni con etanolo a gradiente come segue: 50% per 10 min, 70% per 10 min, 80% per 10 min, 90% per 10 min e 2 x 10 min in etanolo al 100%.
- Disidratare i blocchi di campioni con acetone anidro per 3 x 10 min.
- Infiltrazione di resina
- Infiltrare i blocchi di campioni con resina a gradiente (vedi Tabella dei materiali): acetone a resina 3:1 per 1 ora, acetone a resina 1:1 per 2 ore, acetone a resina 1:3 per 3 ore.
- Sostituire con la resina pura per 3 x 12 h.
- Inclusione in resina
- Trasferire i blocchi di campioni in capsule (vedere Tabella dei materiali) utilizzando uno stuzzicadenti.
- Aggiungere resina pura nella capsula contenente il blocco di campioni e polimerizzare la resina in forno a 60 °C per 14-16 ore.
3. Rivestimento del vetro di copertura con nanoparticelle d'oro
- Pulizia del vetro di copertura
- Lavare i vetri di copertura con tampone detergente (vedi Tabella dei materiali) per 2 ore a 142 °C.
- Risciacquare il tampone detergente 3 x 10 min con ddH2O.
- Trasferire con cautela i copribicchieri in un becher contenente alcol etilico anidro e incubare per una notte.
- Asciugare all'aria i copriocchiali su una panca pulita per diversi minuti.
- Rivestire gli occhiali di copertura con nanoparticelle d'oro.
- Fissare un vetrino al centro della rotazione di una centrifuga da tavolo (vedi Tabella dei materiali) utilizzando il cemento di vetro.
- Montare un vetro di copertura al centro del vetrino utilizzando dei post-it.
- Aggiungere 75 μL di pioloformio all'1% (vedere la tabella dei materiali) sul vetro di copertura.
NOTA: Abbiamo testato anche Formvar (vedi Tabella dei Materiali) e funziona bene. - Centrifugare per 3 minuti a 1.360 × g (Figura 2A) per produrre un sottile strato di pioloformio sulla superficie del vetro di copertura.
- Incubare la superficie del vetro di copertura con 250 μL di poli-L-lisina allo 0,1% (vedere la tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente (Figura 2B).
- Risciacquare con ddH2O e asciugare all'aria il vetro di copertura per alcuni minuti.
- Diluire nanoparticelle d'oro a 80 nm (vedi Tabella dei Materiali) con ddH2O al 25% (v/v, OD600 = 0,07) (Vedi Tabella dei Materiali) e sonicare per 15 min.
- Incubare la superficie del vetro di copertura con le nanoparticelle d'oro diluite per 1 ora a temperatura ambiente (Figura 2C).
- Risciacquare con ddH2O e asciugare all'aria il vetro di copertura per alcuni minuti.
NOTA: Funziona bene 2 settimane dopo essere stato rivestito con nanoparticelle di pioloforme e oro. Ma si consiglia di utilizzarlo subito dopo essere stato rivestito.
4. Sezionamento ultrasottile
- Tagliate la superficie del blocco campione in un trapezio ad angolo retto. Tagliare sezioni ad uno spessore di 100 nm utilizzando un coltello diamantato (vedi Tabella dei materiali) con un ultramicrotomo (vedi Tabella dei materiali). Separare una singola sezione dalla fascia di sezione e far galleggiare la singola sezione nel bagnomaria.
- Aggiungi una goccia di ddH2O al centro del vetro di copertura rivestito di nanoparticelle d'oro. Prelevare una sezione utilizzando un anello di campionamento e capovolgere l'anello di campionamento sulla superficie della goccia d'acqua. Rimuovere l'anello del campione, lasciando la sezione sulla superficie della goccia d'acqua.
- Asciugare il vetro di copertura all'aria per diversi minuti. Disegna un anello attorno alla sezione sul lato opposto del vetro di copertura usando un pennarello.
5. Imaging al microscopio ottico
- Recupero della fluorescenza
NOTA: Il flusso di lavoro è mostrato nella Figura 3A.- Aggiungere 10 μL di tampone di montaggio (vedere la tabella dei materiali) sulla sezione ultrasottile del vetro di copertura. Posizionare un nuovo vetro di copertura pulito sul tampone di montaggio.
NOTA: Il componente chiave del tampone di montaggio è DABCO, che viene utilizzato per recuperare la fluorescenza delle proteine fluorescenti. Questo è molto importante per il recupero della fluorescenza. - Mettere questi due vetri di copertura insieme alla sezione ultrasottile in una camera di imaging (vedere la tabella dei materiali). Assicurarsi che il vetro di copertura con l'anello disegnato sia in alto.
- Aggiungere 10 μL di tampone di montaggio (vedere la tabella dei materiali) sulla sezione ultrasottile del vetro di copertura. Posizionare un nuovo vetro di copertura pulito sul tampone di montaggio.
- Raccogli la mappa di navigazione.
- Trova la sezione utilizzando l'anulus disegnato come marcatore in modalità di imaging in campo chiaro di un microscopio a fluorescenza invertita (vedi Tabella dei materiali). Spostati in un angolo della sezione. Accendi la luce bianca e scatta l'immagine in campo chiaro.
- Spegni la luce bianca. Accendere il laser (561 nm) e scattare immagini fluorescenti dello stesso campo visivo (FOV).
- Spegnere il laser. Spostati sul campo visivo adiacente, assicurandoti che questi due campi visivi abbiano una sovrapposizione del 10%. Prendi l'immagine in campo chiaro e l'immagine fluorescente del secondo FOV.
- Ripetere l'operazione fino a coprire l'intera sezione. Registrare il percorso di imaging che può essere utilizzato per unire il FOV.
NOTA: Per una maggiore qualità dell'immagine, si consiglia di utilizzare il microscopio confocale.
- Celle dell'immagine di interesse.
- Utilizzare la mappa di navigazione per individuare facilmente le celle di interesse. Accendere il laser (561 nm) e scattare 300 fotogrammi di immagini fluorescenti della cellula di interesse. Spegnere il laser.
- Accendi la luce bianca e scatta immagini in campo chiaro sequenziale (~100 fotogrammi).
- Passare a un'altra cella di interesse.
6. Preparazione per l'imaging EM
NOTA: Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 3B.
- Trasferire la sezione ultrasottile sulla griglia delle fessure.
- Riempire un barattolo di vetro con ddH2O.
- Rimuovere i vetri di copertura dalla camera e separare i due vetri di copertura con una pinzetta. Clamp il vetro di copertura su cui si trova la sezione, lavare via il tampone di montaggio e asciugare all'aria.
- Incidere un # attorno alla sezione ultrasottile utilizzando una lama su un solo lato e far cadere 10 μL di acido fluoridrico al 12% (vedere la tabella dei materiali) in corrispondenza di ciascun angolo del #. Immergere lentamente il coperchiochio.
NOTA: L'acido fluoridrico reagisce con il vetro, facilitando la rimozione della pellicola pioloformica dal vetro di copertura. L'acido fluoridrico è tossico. Usalo in un cappuccio chimico con i guanti. Il contatto con la pelle richiede cure mediche immediate. - Far galleggiare insieme il film pioloforme e la sezione ultrasottile sulla superficie dell'acqua. Posizionate una griglia di asole non rivestita sulla sezione per catturare la sezione al centro della griglia.
- Coprire un vetrino con parafilm (vedi Tabella dei materiali) e prelevare la griglia con il film pioloforme. Asciugare la griglia all'aria a temperatura ambiente.
- Colorazione della sezione
- Macchia la sezione con il 2% UA e il triplo vantaggio di Sato. Per maggiori dettagli, fare riferimento al protocollo2 pubblicato in precedenza.
7. Analisi dell'immagine
- Unisci la mappa di navigazione.
- Individuare la posizione dei dati non elaborati. Aprire il software ImageJ (vedere Tabella dei materiali) per unire la mappa di navigazione.
- Fare clic su Plugin | Cuciture | Cucitura a griglia/collezione | (Tipo) Griglia: serpente per colonna | (Ordine) Su e sinistra (in base alla sequenza di ripresa) | Impostare la dimensione della sezione | Selezionare il percorso dati | Imposta nome file | Selezionare Fusione schermo. Osservate il risultato, che è una mappa di navigazione composta da diverse immagini in campo chiaro di diversi FOV.
- Utilizzare lo stesso metodo per unire una mappa di navigazione della fluorescenza.
- Unire le immagini in campo chiaro con le immagini a fluorescenza.
- Nel software ImageJ, fare clic su File | Importazione | Sequenza di immagini per importare le immagini sequenziali in campo chiaro della cella di interesse.
- Clicca sull'immagine | Pile | Proiezione Z | Somma sezioni per ottenere l'immagine SIP (Sum Intensity Projection) delle immagini sequenziali in campo chiaro.
- Fare clic su Modifica | Inverti per invertire l'immagine SIP del campo chiaro in modo che i segnali delle nanoparticelle d'oro diventino punti bianchi luminosi.
- In ImageJ, fare clic su File | Importazione | Sequenza di immagini per importare le immagini FM sequenziali.
- Clicca sull'immagine | Pile | Proiezione Z | Somma sezioni per ottenere l'immagine SIP delle immagini FM sequenziali.
- Clicca sull'immagine | Colore | Unisci canali per unire l'immagine in campo chiaro SIP con l'immagine SIP FM come immagine composita.
- Le nanoparticelle d'oro sono verdi e la proteina fluorescente è rossa. Clicca sull'immagine | Tipologia | Colore RGB per convertire il formato dell'immagine composita in RGB.
8. Imaging EM
- Posizionare la griglia sul supporto del campione, mantenendo il lato della sezione della griglia rivolto verso l'alto.
- Utilizzare la mappa di navigazione per identificare approssimativamente la posizione delle celle corrispondenti al microscopio elettronico attraverso quattro distanze relative ai quattro diversi angoli del trapezio destro della sezione ultrasottile.
- Confermare le cellule usando le nanoparticelle d'oro.
- Acquisisci immagini EM a diversi ingrandimenti (4.200x, 6.000x o 8.200x) con un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) (vedi Tabella dei materiali).
9. Registrazione dell'immagine FM con l'immagine EM
- Aprire il software di registrazione (vedere l'Indice dei materiali). Digitare easyCLEMv014nella finestra di ricerca. Fare clic su easyCLEMv0 per aprire easyCLEMv0. Fare clic su Immagine/Sequenza | Apri per importare l'immagine EM e l'immagine composita nel pannello del software.
- Nella finestra EasyCLEMv0, fare clic su 2D (x,y,[T]) per scegliere non rigido (2D o 3D) come modalità di allineamento.
- Nella finestra EasyCLEMv0, fare clic sulla casella a discesa a destra di Seleziona immagine che verrà trasformata e ridimensionata (probabilmente FM) per scegliere Composito (RGB)color.tif. Quindi, fai clic sulla casella a discesa a destra di Seleziona immagine che non verrà modificata (probabilmente EM) per scegliere EMimage. tif.
- Fare clic su Avvia per iniziare la registrazione.
- Nella finestra dell'immagine EM denominata EMimage. tif, fare clic su una nanoparticella d'oro per inserire il punto 1 sulla nanoparticella d'oro. Nella finestra dell'immagine FM denominata Composite (RGB)color.tif, fare clic sulla nanoparticella d'oro corrispondente per inserire il punto 1 sulla nanoparticella d'oro.
- Fare clic su Update Transformation per confermare il segnale LM con il segnale EM delle nanoparticelle d'oro.
- Ripeti l'operazione di cui sopra nella finestra dell'immagine EM denominata EMimage. tif e abbina il segnale LM con il segnale EM della stessa nanoparticella d'oro uno per uno.
- Fare clic su Stop per completare la registrazione.
- Dopo l'allineamento dell'immagine, fare clic su Immagine sovrapposta e fare clic su Immagine/Sequenza | Salva con nome per esportare una pila di immagini contenente immagini di quattro canali (rosso, verde, blu, grigio).
- Apri ImageJ e fai clic su File | Apri per importare l'immagine sovrapposta . Clicca sull'immagine | Pile | Impila su immagini per separare l'immagine sovrapposta in immagini a quattro canali.
- Clicca sull'immagine | Colore | Unisci canali per unire le immagini di tre canali (rosso, verde e grigio) in un'immagine composita.
- Clicca sull'immagine | Tipologia | Colore RGB per convertire l'immagine composita in un'immagine CLEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rapporti precedenti hanno dimostrato che mScarlet può colpire il lisosoma15. In questo protocollo, l'AAV che esprime mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) è stato iniettato nell'M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) del cervello di topo Vglut2-ires-cre utilizzando strumenti stereotassici. Seguendo il protocollo sopra descritto, l'immagine finale correlata è mostrata in Figura 4A. L'immagine FM può essere allineata con precisione con l'immagine EM utilizzando nanoparticelle d'oro (i punti verdi) come marcatori fiduciali. Come mostrato nell'immagine EM (Figura 4C,F), mScarlet ha preso di mira il lisosoma e il contenuto all'interno dei lisosomi è eterogeneo, che sono le caratteristiche tipiche del lisosoma secondario.
Figura 1: Panoramica schematica della microscopia ottica ed elettronica correlativa. (A) Preparazione del cervello del topo. I virus adeno-associati sono stati iniettati nel cervello del topo. Dopo 30 giorni, le regioni fluorescenti delle fette di cervello di topo sono state tagliate in piccoli blocchi per la preparazione del campione EM. (B) Preparazione del campione EM. (C) Sezione ultrasottile con coltello diamantato e diagramma schematico del vetro di copertura. (D) Imaging FM e imaging TEM. Abbreviazioni: EM = microscopia elettronica; FM = microscopia a fluorescenza; TEM = microscopia elettronica a trasmissione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rivestimento dei vetri di copertura con nanoparticelle d'oro. (A) Coprire il vetro di copertura con pioloformio mediante centrifugazione. (B) Incubare la superficie del vetro di copertura con poli-L-lisina. (C) Incubare la superficie del vetro di copertura con le nanoparticelle d'oro diluite. (D) Schema del vetro di copertura rivestito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il programma dei preparativi per l'imaging FM e l'imaging EM. (A) Il flusso di lavoro delle preparazioni per l'imaging FM consiste in cinque fasi: (i) raccogliere la sezione ultrasottile, (ii) asciugare all'aria, (iii) posizionare un secondo vetro di copertura dopo aver aggiunto il tampone, (iv) fissare entrambi i vetri di copertura nella camera e l'imaging FM. (B) Anche il flusso di lavoro delle preparazioni per l'imaging EM consiste in cinque fasi: (i) separazione dei due vetri di copertura, (ii) flottazione della sezione ultrasottile, (iii) raccolta della sezione ultrasottile, (iv) spostamento della sezione ultrasottile sulla griglia a fessura e (v) imaging EM. Abbreviazioni: EM = microscopia elettronica; FM = microscopia a fluorescenza; TEM = microscopia elettronica a trasmissione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine CLEM rappresentativa di mScarlet. (A) L'immagine CLEM dell'intero neurone. (B,E) Le immagini CLEM del riquadro. (C,F) Le immagini EM del riquadro. (D,G) Le immagini di fluorescenza del riquadro. I punti verdi indicano nanoparticelle d'oro. Barra della scala = 5 μm (A), 1 μm (immagini nel riquadro). Abbreviazioni: EM = microscopia elettronica; FM = microscopia a fluorescenza; CLEM = microscopia ottica ed elettronica correlativa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo qui presentato è un metodo di imaging versatile, in grado di combinare le informazioni di localizzazione della proteina bersaglio dalla microscopia ottica (LM) e il contesto che circonda la proteina bersaglio dalla microscopia elettronica (EM)6. Con i limiti delle attuali proteine fluorescenti, il metodo ampiamente utilizzato è il pre-embedding della microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM), il che significa che l'imaging LM viene eseguito prima della preparazione del campione EM. Quasi tutte le proteine fluorescenti esistenti possono essere esaminate in CLEM pre-embedding. Tuttavia, a causa delle inevitabili distorsioni e restringimenti, è impossibile un allineamento accurato dell'immagine finale6. Pertanto, le informazioni fornite dal pre-embedding di CLEM sono quelle di controllare le ultrastrutture della stessa cellula fotografata da LM nell'imaging EM.
Il metodo fornito da questo studio è il CLEM post-embedding, in cui l'imaging LM viene eseguito dopo la preparazione del campione EM. Il restringimento causato dalla fissazione chimica nella preparazione del campione EM non influisce sull'allineamento accurato dell'immagine finale. Inoltre, poiché sia l'imaging LM che l'imaging EM vengono eseguiti sulla stessa sezione e con l'aiuto di nanoparticelle d'oro, l'allineamento finale dell'immagine può essere molto accurato. Il CLEM post-inclusione richiede che le proteine fluorescenti mantengano un segnale fluorescente dopo la preparazione convenzionale del campione EM. In precedenza, avevamo segnalato la prima proteina fluorescente chiamata mEosEM, che può trattenere i segnali fluorescenti utilizzando Epon come resinadi inclusione 8. Rispetto ad altre resine come resine di inclusione, Epon ha proprietà superiori di conservazione dell'ultrastruttura e sezionamento. A seguito di mEosEM, sono state segnalate altre proteine fluorescenti resistenti all'inclusione di Epon, come mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E 8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 e HfYFP 9.
Secondo la nostra esperienza, mScarlet è superiore ad altre proteine fluorescenti. La soluzione fissativa può influenzare la fluorescenza delle proteine fluorescenti. In generale, la velocità di fissazione della paraformaldeide (PFA) è molto più lenta di quella della glutaraldeide (GA); al contrario, il PFA penetra nel campione più rapidamente rispetto al GA più grande. Una miscela di PFA e GA fornisce un equilibrio tra il fissaggio del campione abbastanza rapidamente da mantenerne la qualità, ma abbastanza lentamente da evitare danni al campione, come l'ossidazione. La maggiore concentrazione di GA produrrà una maggiore autofluorescenza. Dalla nostra esperienza, la fluorescenza di mScarlet in blocco di resina può essere rilevata 6 mesi dopo la polimerizzazione. Ma si consiglia di eseguire l'imaging CLEM immediatamente dopo la polimerizzazione.
Un altro fattore chiave nel post embedding CLEM è come registrare l'immagine LM con l'immagine EM in modo accurato. Sulla base dei metodi 6,21 precedentemente riportati, abbiamo apportato alcune modifiche al protocollo. Il primo è come trovare la stessa cellula immaginata da LM nell'imaging EM. Abbiamo preso diversi FOV per unire la mappa di navigazione dell'intera sezione ultrasottile utilizzando la modalità di imaging DIC e fluorescenza. Utilizzando la mappa di navigazione, è stato possibile identificare facilmente le celle di interesse. Un altro miglioramento è l'allineamento accurato dell'immagine. In precedenza, abbiamo utilizzato il segnale fluorescente in modalità di imaging a fluorescenza e un segnale ad alto contrasto elettronico in modalità di imaging EM delle nanoparticelle d'oro come marcatori di allineamento fiduciale6. Tuttavia, quando si utilizzava mScarlet, il segnale fluorescente di mScarlet era molto più alto del segnale fluorescente delle nanoparticelle d'oro ed era difficile rilevare il segnale fluorescente delle nanoparticelle d'oro. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato il segnale in campo chiaro delle nanoparticelle d'oro per la registrazione invece del segnale fluorescente. Seguendo questo protocollo modificato, è stato facile eseguire CLEM post-embedding.
Tuttavia, ci sono alcune limitazioni del protocollo attuale, che dovrebbero essere prese in considerazione prima di utilizzarlo. Sebbene funzioni bene nel sistema di sovraespressione, la fluorescenza è piuttosto debole se le proteine bersaglio sono sotto il loro promotore nativo22. Un'altra limitazione è che, sebbene mScarlet sia la migliore proteina fluorescente (secondo la nostra esperienza) in grado di trattenere abbastanza segnali di fluorescenza dopo la preparazione del campione EM e funzioni bene nelle cellule di mammifero, sarà un problema quando si utilizza mScarlet come tag fluorescente nei neuroni, il che può portare alla posizione errata delle proteine bersaglio15. In questi casi, suggeriamo di utilizzare oScarlet15, una mutazione di mScarlet, che funziona bene nei neuroni.
Le potenziali applicazioni di questo protocollo modificato possono essere suddivise in due categorie. Il primo è quello di ingrandire il livello subcellulare, il che significa studiare la proteina bersaglio nel contesto subcellulare. Nei nostri rapporti pubblicati in precedenza, abbiamo utilizzato CLEM post-embedding per esaminare la formazione di compartimenti di assemblaggio di virioni citoplasmatici (cVAC) durante l'infezione da un γ-herpesvirus23. Nelle applicazioni future, il CLEM post-embedding può essere combinato con la tomografia elettronica per ottenere la distribuzione 3D delle proteine bersaglio e risolvere la struttura 3D in modo nativo24. Il secondo tipo di potenziale applicazione è lo zoom indietro a livello cellulare, che può essere utilizzato per disegnare e analizzare i circuiti neurali. Grazie alla sua capacità di alta risoluzione, l'EM è diventato un mezzo efficace per mappare le connessioni cerebrali sottili. Tuttavia, EM non è in grado di fornire con precisione l'identità dei neuroni, il che limita l'analisi approfondita del circuito neuronale. Epon post-embedding CLEM ha il potenziale per portare le identità dei neuroni nel circuito neuronale senza compromettere le ultrastrutture.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32201235 a Zhifei Fu), dalla Natural Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (2022J01287 a Zhifei Fu), dalla Research Foundation for Advanced Talents presso la Fujian Medical University, Cina (XRCZX2021013 a Zhifei Fu), dalla Finance Special Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (22SCZZX002 a Zhifei Fu), Fondazione del laboratorio chiave NHC di valutazione tecnica della regolazione della fertilità per primati non umani e dell'ospedale per la salute della maternità e del bambino del Fujian (2022-NHP-04 a Zhifei Fu). Ringraziamo Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin e Yan Hu presso il Public Technology Service Center della Fujian Medical University per il supporto nella preparazione dei campioni EM e nell'imaging EM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
