Summary
אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופ אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הטבעה של Epon באמצעות חלבון פלואורסצנטי הנקרא mScarlet. שיטה זו יכולה לשמור על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. טכניקה זו מקובלת על מגוון רחב של יישומים ביולוגיים.
Abstract
מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאמי (CLEM) הוא מיקרוסקופ מקיף המשלב את מידע הלוקליזציה המסופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM) ואת ההקשר של אולטרה-מבנה תאי שנרכש על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). CLEM הוא פשרה בין פלואורסצנטיות לאולטרה-מבנה, ובדרך כלל, אולטרה-מבנה פוגע בפלואורסצנטיות. בהשוואה לשרפים הידרופיליים אחרים, כגון גליצידיל מתקרילט, HM20 או K4M, Epon מעולה בתכונות שימור וחיתוך אולטרה-מבנה. בעבר, הוכחנו כי mEosEM יכול לשרוד קיבוע אוסמיום טטרוקסיד והטבעה של אפון. באמצעות mEosEM השגנו לראשונה הטמעת גבי Epon CLEM, השומרת על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. כאן, אנו מספקים פרטים שלב אחר שלב על הכנת דגימת EM, הדמיית FM, הדמיית EM ויישור התמונה. אנו גם משפרים את ההליכים לזיהוי אותו תא שצולם על ידי הדמיית FM במהלך הדמיית EM ומפרטים את הרישום בין תמונות FM ו- EM. אנו מאמינים שניתן להשיג בקלות הטמעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר Epon בעקבות פרוטוקול חדש זה במתקני EM מסורתיים.
Introduction
ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM) כדי להשיג לוקליזציה והפצה של חלבון היעד. עם זאת, ההקשר המקיף את חלבון המטרה הולך לאיבוד, וזה חיוני לחקירה יסודית של חלבון המטרה. למיקרוסקופ אלקטרונים (EM) יש את רזולוציית ההדמיה הגבוהה ביותר, והוא מספק מספר פרטים תת-תאיים. עם זאת, EM חסר תיוג מטרה. על ידי מיזוג מדויק של התמונה הפלואורסצנטית שצולמה על ידי FM עם התמונה האפורה שנרכשה על ידי EM, אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים (CLEM) יכול לשלב את המידע המתקבל על ידי שני מצבי הדמיה אלה 1,2,3,4.
CLEM הוא פשרה בין פלואורסצנטיות לבין ultrastructure1. בגלל המגבלות של חלבונים פלואורסצנטיים הנוכחיים ונהלי הכנת דגימות EM מסורתיים, במיוחד השימוש בחומצה אוסמית (OsO4) ושרפים הידרופוביים כגון אפון, מבנה העל תמיד פוגע בפלואורסצנטיות5. OsO4 הוא מגיב חיוני בהכנת מדגם EM, המשמש לשיפור הניגודיות של תמונות EM. בהשוואה לשרפים מוטמעים אחרים, Epon מעולה בתכונות שימור וחיתוך אולטרה-מבנה5. עם זאת, אין חלבונים פלואורסצנטיים שיכולים לשמור על האות הפלואורסצנטי לאחר הטיפול ב-OsO4 ובהטבעה של Epon6. כדי להתגבר על מגבלות החלבונים הפלואורסצנטיים, פותחה הטמעה מוקדמת של LEM, שבה מתבצעת הדמיית FM לפני הכנת דגימת EM6. עם זאת, החיסרון של הטמעה מראש CLEM הוא הרישום הלא מדויק בין FM לבין תמונות EM5.
להיפך, שיטת CLEM לאחר הטבעה מבצעת את הדמיית FM לאחר הכנת דגימת EM, שדיוק הרישום שלה יכול להגיע ל 6-7 ננומטר 5,6. כדי לשמור על הפלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים, נעשה שימוש בריכוזים נמוכים מאוד של OsO4 (0.001%)3 או בשיטות ההכנה של EM בלחץ גבוה (HPF) והחלפת הקפאה (FS) 4,7 על חשבון מבנה העל שנפרץ או הניגודיות של תמונת ה- EM. הפיתוח של mEos4b מקדם מאוד את ההתקדמות של לאחר הטבעה CLEM, אם כי glycidyl methacrylate משמש שרף הטבעה5. עם הפיתוח של mEosEM, אשר יכול לשרוד את צביעת OsO4 והטבעה Epon, Epon פוסט הטבעה CLEM סופר רזולוציה הושגה בפעם הראשונה, שמירה על פלואורסצנטיות ו ultrastructure בו זמנית6. לאחר mEosEM, מספר חלבונים פלואורסצנטיים שיכולים לשרוד את צביעת OsO4 ואת הטבעה Epon פותחו 8,9,10,11. זה מאוד מקדם את הפיתוח של CLEM.
ישנם שלושה היבטים עיקריים ל- Epon לאחר הטמעת CLEM. הראשון הוא חלבון פלואורסצנטי, אשר אמור לשמור על האות הפלואורסצנטי לאחר הכנת דגימת EM. על פי הניסיון שלנו, mScarlet עדיף על חלבונים פלואורסצנטיים אחרים שדווחו. השני הוא כיצד למצוא את אותו תא שצולם על ידי דימות FM בדימות EM. כדי לפתור בעיה זו, אנו משפרים את ההליך עבור שלב זה, כך שניתן למצוא בקלות את תא היעד. האחרון הוא השיטה ליישר את תמונת FM עם תמונת EM. כאן, אנו מפרטים את הרישום בין FM לבין תמונות EM. בפרוטוקול זה, אנו מבטאים mScarlet בתאי עצב VGLUT2 ומדגימים כי mScarlet יכול להתמקד בליזוזומים משניים באמצעות Epon לאחר הטבעה CLEM. אנו מספקים פרטים שלב אחר שלב עבור Epon לאחר הטמעת CLEM, מבלי להתפשר על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
גידול בעלי חיים וניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי האוניברסיטאי הרפואי פוג'יאן. זרימת העבודה שלב אחר שלב של הפרוטוקול הנוכחי מוצגת באיור 1.
1. הכנת מדגם
- מוח עכבר
- רכשו עכברים טרנסגניים (ראו טבלת חומרים) ופריימרים אוליגונוקלאוטידים (ראו טבלת חומרים) לגנוטיפ עכברים אלה.
- לנקב ולהסיר את המוח השלם מקמרון הגולגולת בהתאם לפרוטוקול12,13 שפורסם בעבר.
- תקן את מוח העכבר באמצעות 10 מ"ל של תמיסה מקובעת (ראה טבלת חומרים) ב 4 ° C במשך הלילה.
- שטפו את תמיסת הקיבוע במשך 3 x 10 דקות עם חיץ פוספט באורך 0.1 מ' (PB).
- חתכו את מוח העכבר למקטעים בעובי 500 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום מתנדנד (ראו טבלת חומרים).
- חתכו את האזורים הפלואורסצנטיים לגושים קטנים בעזרת אזמל באמצעות סטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים).
הערה: נפח הבלוקים הקטנים לא יכול להיות גדול מ- 1 מ"מ3.
- תאים בתרבית
- זרעו תאי HeLa לתוך צלחות תרבית תאים בקוטר 6 ס"מ ושמרו עליהם במדיום גדילה (גלוקוז נמוך של Eagle medium [DMEM] של Dulbecco, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי [FBS]).
- ביום המחרת, העבירו את הפלסמידים המכילים mScarlet לתאים באמצעות מגיב טרנספקציה של DNA (ראו טבלת חומרים) בהתאם לספר ההוראות של ערכת הטרנספקציה.
- ארבעים ושמונה שעות לאחר הטרנספקציה, טריפסינזציה של התאים הנגועים וצנטריפוגה אותם כדי לקבל כדורי תאים ב 1,000 × גרם. כדורי התא נקראים בלוקים לדוגמה.
2. הכנת דגימת EM
- קיבוע
- תקן את הבלוקים לדוגמה באמצעות פתרון קיבוע (ראה טבלת חומרים) ב- 4 ° C למשך הלילה.
- הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף את תמיסת הקיבוע במשך 3 x 10 דקות עם PB 0.1 M מאבני הדגימה.
- צביעת אוסמיום טטרוקסיד (OsO4)
- תקן את בלוקי הדגימה עם תמיסת OsO4 (ראה טבלת חומרים) ב- 4 ° C למשך שעה אחת.
- הסר את תמיסת OsO4 ושטוף את תמיסת OsO4 3 x 10 דקות עם ddH2O מאבני הדגימה.
- צביעת אורניל אצטט (UA)
- צבעו את גושי הדגימה באמצעות תמיסת UA 2% (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת.
- הסר את תמיסת UA ושטוף את בלוקי הדגימה עם ddH2O במשך 3 x 10 דקות.
- התייבשות הדרגתית
- יש לייבש את גושי הדגימה באתנול הדרגתי באופן הבא: 50% למשך 10 דקות, 70% למשך 10 דקות, 80% למשך 10 דקות, 90% למשך 10 דקות ו-2 x 10 דקות באתנול 100%.
- יש לייבש את גושי הדגימה עם אצטון נטול מים למשך 3 x 10 דקות.
- חדירת שרף
- הסתננו לגושי הדגימה עם שרף הדרגתי (ראה טבלת חומרים): אצטון לשרף 3:1 למשך שעה אחת, אצטון לשרף 1:1 למשך שעתיים, אצטון לשרף 1:3 למשך 3 שעות.
- החלף עם שרף טהור במשך 3 x 12 שעות.
- שיבוץ שרף
- העבירו קוביות דגימה לכמוסות (ראו טבלת חומרים) באמצעות קיסם.
- מוסיפים שרף טהור לקפסולה המכילה את גוש הדגימה ומפילמרים את השרף בתנור ב-60°C למשך 14-16 שעות.
3. ציפוי הזכוכית בננו-חלקיקי זהב
- ניקוי זכוכית כיסוי
- שטפו את כוסות הכיסוי עם חיץ ניקוי (ראו טבלת חומרים) למשך שעתיים בטמפרטורה של 142°C.
- יש לשטוף את מאגר הניקוי 3 x 10 דקות עם ddH2O.
- מעבירים את משקפי הכיסוי בזהירות לתוך המכילה אלכוהול אתילי נטול מים ודגרים למשך הלילה.
- יבשו באוויר את הכיסויים על ספסל נקי למשך מספר דקות.
- צפו את משקפי הכיסוי בננו-חלקיקי זהב.
- תקן שקופית זכוכית במרכז הסיבוב של צנטריפוגה שולחנית (ראה טבלת חומרים) באמצעות מלט זכוכית.
- הרכיבו זכוכית במרכז מגלשת הזכוכית באמצעות פתקים דביקים.
- יש להוסיף 75 μL של 1% pioloform (ראו טבלת חומרים) על זכוכית הכיסוי.
הערה: בדקנו גם את Formvar (ראה טבלת חומרים) והוא עובד היטב. - הסתובבו במשך 3 דקות במהירות של 1,360 × גרם (איור 2A) כדי ליצור שכבה דקה של פיולופורם על פני השטח של זכוכית הכיסוי.
- דגרו על משטח הזכוכית עם 250 מיקרוליטר של 0.1% פולי-L-ליזין (ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (איור 2B).
- יש לשטוף עם ddH2O ולייבש את הכוס באוויר למשך מספר דקות.
- לדלל ננו-חלקיקי זהב בגודל 80 ננומטר (ראה טבלת חומרים) עם ddH2O עד 25% (v/v, OD600 = 0.07) (ראה טבלת חומרים) וסוניקט במשך 15 דקות.
- דגרו על משטח הזכוכית עם ננו-חלקיקי הזהב המדוללים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (איור 2C).
- יש לשטוף עם ddH2O ולייבש את הכוס באוויר למשך מספר דקות.
הערה: זה עובד היטב 2 שבועות לאחר מצופה pioloform ו ננו חלקיקי זהב. אך אנו ממליצים להשתמש בו מיד לאחר הציפוי.
4. חתך דק במיוחד
- חתכו את פני השטח של גוש הדגימה לטרפז ישר זווית. חותכים חתכים בעובי של 100 ננומטר באמצעות סכין יהלום (ראו טבלת חומרים) עם אולטרה-מיקרוטום (ראו טבלת חומרים). הפרד קטע אחד מרצועת הקטע וצף את החלק היחיד באמבט המים.
- הוסיפו טיפה של ddH2O למרכז זכוכית הכיסוי המצופה בננו-חלקיקי זהב. הרימו קטע באמצעות לולאת דגימה והפכו את לולאת הדגימה על פני השטח של טיפת המים. הסר את לולאת הדגימה, והשאיר את החלק על פני השטח של טיפת המים.
- יבשו את הכוס באוויר למשך מספר דקות. ציירו טבעת מסביב לחלק בצד הנגדי של זכוכית הכיסוי באמצעות עט טוש.
5. הדמיית מיקרוסקופ אור
- התאוששות פלואורסצנטית
הערה: זרימת העבודה מוצגת באיור 3A.- הוסף 10 μL של חיץ הרכבה (ראה טבלה של חומרים) לחלק הדק במיוחד על זכוכית הכיסוי. הניחו זכוכית כיסוי נקייה חדשה על מאגר ההרכבה.
הערה: רכיב המפתח של מאגר ההרכבה הוא DABCO, המשמש לשחזור הפלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים. זה חשוב מאוד להתאוששות פלואורסצנטית. - הכניסו את שני משקפי הכיסוי הללו יחד עם החלק האולטרה-דק לתוך תא הדמיה (ראו טבלת חומרים). ודא שהכיסוי עם הטבעת המצוירת נמצא בחלק העליון.
- הוסף 10 μL של חיץ הרכבה (ראה טבלה של חומרים) לחלק הדק במיוחד על זכוכית הכיסוי. הניחו זכוכית כיסוי נקייה חדשה על מאגר ההרכבה.
- אסוף את מפת הניווט.
- מצא את המקטע באמצעות הטבעת המשורטטת כסמן במצב הדמיה בשדה בהיר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (ראה טבלת חומרים). מעבר לפינה אחת של המקטע. הפעל את האור הלבן וצלם את תמונת שדה הבהירות.
- כבו את האור הלבן. הפעל את הלייזר (561 ננומטר) וצלם תמונות פלורסנט של אותו שדה ראייה (FOV).
- כבה את הלייזר. עבור ל- FOV הסמוך, וודא שלשני FOV אלה יש חפיפה של 10%. צלם את תמונת השדה הבהיר ואת התמונה הפלואורסצנטית של ה- FOV השני.
- חזור על פעולה זו עד שכל המקטע מכוסה. הקלט את נתיב ההדמיה שניתן להשתמש בו כדי לתפור את ה- FOV.
הערה: לקבלת איכות גבוהה יותר של התמונה, אנו ממליצים להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי.
- תאי תמונה מעניינים.
- השתמש במפת הניווט כדי למקד בקלות תאים מעניינים. הפעל את הלייזר (561 ננומטר) וצלם 300 מסגרות של תמונות ניאון של התא המעניין. כבה את הלייזר.
- הפעל את האור הלבן וצלם תמונות שדה בהיר רציפות (~ 100 מסגרות).
- מעבר לתא אחר של עניין.
6. הכנה להדמיית EM
הערה: זרימת העבודה מוצגת באיור 3B.
- העבר את המקטע הדק במיוחד לרשת החריץ.
- ממלאים צנצנת זכוכית ב-ddH2O.
- הוציאו את משקפי הכיסוי מהחדר והפרידו את שני הכיסויים בעזרת פינצטה. הדקו את זכוכית הכיסוי שעליה ממוקם המקטע, שטפו את חיץ ההרכבה וייבשו באוויר.
- ציון # סביב החלק הדק במיוחד באמצעות להב חד צדדי ולשחרר 10 μL של 12% חומצה הידרופלואורית (ראה טבלת חומרים) בכל פינה של #. הכניסו את הכוס באיטיות למים.
הערה: חומצה הידרופלואורית מגיבה עם זכוכית, מה שמקל על הסרת סרט הפיופורם מזכוכית הכיסוי. חומצה הידרופלואורית היא רעילה. השתמש בו במכסה מנוע כימי עם כפפות. מגע עם העור מחייב טיפול רפואי מיידי. - לצוף את הסרט pioloform ואת החלק דק במיוחד על פני המים יחד. מקם רשת חריץ לא מצופה במקטע כדי ללכוד את המקטע במרכז הרשת.
- כסו שקופית זכוכית בפרפילם (ראו טבלת חומרים) והרימו את הרשת בעזרת סרט הפיופורם. יש לייבש את הרשת באוויר בטמפרטורת החדר.
- צביעת סעיף
- הכתימו את הקטע עם 2% UA ויתרון משולש של סאטו. לקבלת פרטים נוספים, עיין בפרוטוקול2 שפורסם בעבר.
7. ניתוח תמונות
- תפר את מפת הניווט.
- מצא את המיקום של הנתונים הגולמיים. פתח את התוכנה ImageJ (ראה טבלת חומרים) כדי לתפור את מפת הניווט.
- לחץ על תוספים | תפירה | תפירת רשת/איסוף | (סוג) רשת: נחש לפי עמוד | (סדר) למעלה ומשמאל (לפי רצף ירי) | הגדרת גודל פרוסה | בחר נתיב נתונים | הגדרת שם קובץ | בדוק מיזוג תצוגה. שימו לב לתוצאה, שהיא מפת ניווט המורכבת ממספר תמונות שדה בהיר של FOV שונים.
- השתמש באותה שיטה כדי לתפור מפת ניווט פלואורסצנטית.
- מזג את תמונות שדה הבהירות עם תמונות הפלואורסצנטיות.
- בתוכנה ImageJ, לחץ על קובץ | ייבוא | 'רצף תמונות ' לייבוא תמונות שדה בהיר רציפות של התא המעניין.
- לחץ על תמונה | ערימות | הקרנת Z | סכום פרוסות לקבלת תמונת הקרנת עוצמת סכום (SIP) של תמונות שדה בהיר רציפות.
- לחץ על עריכה | הפוך כדי להפוך את תמונת ה- SIP של שדה הבהיר כך שהאותות של חלקיקי הזהב יהפכו לנקודות לבנות בוהקות.
- ב-ImageJ, לחץ על File | ייבוא | 'רצף תמונות ' לייבוא תמונות FM רציפות.
- לחץ על תמונה | ערימות | הקרנת Z | סכום פרוסות לקבלת תמונת SIP של תמונות FM רציפות.
- לחץ על תמונה | צבע | מזג ערוצים כדי למזג את תמונת שדה הברייטפילד של SIP עם תמונת SIP FM כתמונה ללא הפרדות צבע.
- חלקיקי הזהב ירוקים, והחלבון הפלואורסצנטי אדום. לחץ על תמונה | סוג | צבע RGB להמרת תבנית התמונה ללא הפרדות צבע ל- RGB.
8. הדמיית EM
- העבר את הרשת להחזקת הדגימה, תוך שמירה על צד המקטע של הרשת כלפי מעלה.
- השתמש במפת הניווט כדי לזהות בערך את מיקום התאים המתאימים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים דרך ארבעה מרחקים יחסיים לארבע הפינות השונות של הטרפז הימני של החלק האולטרה-דק.
- אשר את התאים באמצעות ננו-חלקיקי הזהב.
- צלם תמונות EM בהגדלות שונות (4,200x, 6,000x או 8,200x) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) (ראה טבלת חומרים).
9. רישום תמונת FM עם תמונת EM
- פתח את תוכנת הרישום (ראה טבלת חומרים). הקלד easyCLEMv014בחלון החיפוש. לחץ על easyCLEMv0 כדי לפתוח את easyCLEMv0. לחץ על תמונה/רצף | פתח כדי לייבא את תמונת ה- EM ואת התמונה המורכבת ללוח התוכנה.
- בחלון EasyCLEMv0, לחץ על 2D (x,y,[T]) כדי לבחור לא קשיח (2D או 3D) כמצב היישור.
- בחלון EasyCLEMv0, לחץ על התיבה הנפתחת משמאל לתמונה בחר שתשתנה וגודלה ישתנה (ככל הנראה FM) כדי לבחור Composite (RGB)color.tif. לאחר מכן, לחץ על התיבה הנפתחת משמאל לתמונה בחר שלא תשתנה (ככל הנראה EM) כדי לבחור EMimage. tif.
- לחץ על התחל כדי להתחיל את ההרשמה.
- בחלון תמונת EM בשם EMimage. tif, לחץ על ננו-חלקיק זהב אחד כדי לשים את נקודה 1 על ננו-חלקיק הזהב. בחלון תמונת FM בשם Composite (RGB)color.tif, לחץ על ננו-חלקיק הזהב המתאים כדי לשים את נקודה 1 על ננו-חלקיק הזהב.
- לחץ על עדכון טרנספורמציה כדי לאשר את אות LM עם אות EM של ננו-חלקיקי הזהב.
- חזור על הפעולה לעיל בחלון תמונת EM בשם EMimage. tif והתאם את אות LM לאות EM של אותו ננו-חלקיק זהב בזה אחר זה.
- לחץ על עצור כדי לסיים את ההרשמה.
- לאחר יישור התמונה, לחצו על Overlayed image ולחצו על Image/Sequence | שמירה בשם לייצוא אוסף תמונות הכולל תמונות בנות ארבעה ערוצים (אדום, ירוק, כחול, אפור).
- פתח את ImageJ ולחץ על קובץ | פתח כדי לייבא את תמונת השכבת-על . לחץ על תמונה | ערימות | ערמו לתמונות כדי להפריד את התמונה בשכבת-על לתמונות בנות ארבעה ערוצים.
- לחץ על תמונה | צבע | מזג ערוצים למיזוג תמונות משלושה ערוצים (אדום, ירוק ואפור) לתמונה ללא הפרדות צבע.
- לחץ על תמונה | סוג | צבע RGB להמרת התמונה ללא הפרדות צבע לתמונת CLEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דיווחים קודמים הראו כי mScarlet יכול להתמקד בליזוזום15. בפרוטוקול זה, AAV המבטא mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) הוזרק לתוך M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) של מוח העכבר Vglut2-ires-cre באמצעות מכשירים סטריאוטקסיים. בהתאם לפרוטוקול שתואר לעיל, התמונה המתואמת הסופית מוצגת באיור 4A. תמונת FM יכולה להיות מיושרת במדויק עם תמונת EM באמצעות ננו-חלקיקי זהב (הנקודות הירוקות) כסמנים פידוקיאליים. כפי שניתן לראות בתמונת EM (איור 4C,F), mScarlet כיוון את הליזוזום, והתוכן בתוך הליזוזומים הוא הטרוגני, שהם המאפיינים האופייניים של הליזוזום המשני.
איור 1: סקירה סכמטית של אור מתאמי ומיקרוסקופ אלקטרונים. (A) הכנת מוח עכבר. וירוסים הקשורים באדנו הוזרקו למוח העכבר. לאחר 30 יום, האזורים הפלואורסצנטיים של פרוסות מוח העכבר נחתכו לגושים קטנים להכנת דגימת EM. (B) הכנת דגימת EM. (C) חתך דק במיוחד באמצעות סכין יהלום והתרשים הסכמטי של זכוכית הכיסוי. (D) הדמיית FM והדמיית TEM. קיצורים: EM = מיקרוסקופ אלקטרונים; FM = מיקרוסקופ פלואורסצנטי; TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציפוי משקפי כיסוי בננו-חלקיקי זהב. (A) כסו את זכוכית הכיסוי בפיולופורם באמצעות צנטריפוגה. (B) לדגור על משטח הזכוכית עם פולי-L-ליזין. (C) לדגור על משטח זכוכית הכיסוי עם חלקיקי הזהב המדוללים. (D) תרשים סכמטי של זכוכית הכיסוי המצופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: לוח הזמנים של ההכנות להדמיית FM והדמיית EM. (A) תהליך העבודה של התכשירים להדמיית FM מורכב מחמישה שלבים: (i) גריפה של החלק האולטרה-דק, (ii) ייבוש אוויר, (iii) הנחת זכוכית כיסוי שנייה לאחר הוספת החיץ, (iv) קיבוע שני משקפי הכיסוי בתא, והדמיית FM. (B) תהליך העבודה של ההכנות להדמיית EM מורכב גם מחמישה שלבים: (i) הפרדת שני משקפי הכיסוי, (ii) הצפת החלק האולטרה-דק, (iii) גריפה של החלק האולטרה-דק, (iv) העברת החלק האולטרה-דק לרשת החריץ, ו-(v) הדמיית EM. קיצורים: EM = מיקרוסקופ אלקטרונים; FM = מיקרוסקופ פלואורסצנטי; TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונת CLEM מייצגת של mScarlet. (A) תמונת CLEM של תא העצב כולו. (ב,ה) תמונות CLEM של הכניסה. (ג,ו) תמונות EM של הכניסה. (ד,ז) תמונות הפלואורסצנטיות של הכניסה. נקודות ירוקות מצביעות על ננו-חלקיקי זהב. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר (A), 1 מיקרומטר (תמונות משובצות). קיצורים: EM = מיקרוסקופ אלקטרונים; FM = מיקרוסקופ פלואורסצנטי; CLEM = אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן הוא שיטת הדמיה רב-תכליתית, היכולה לשלב את מידע הלוקליזציה של חלבון המטרה ממיקרוסקופ אור (LM) ואת ההקשר סביב חלבון המטרה ממיקרוסקופ אלקטרונים (EM)6. עם המגבלות של חלבונים פלואורסצנטיים הנוכחיים, השיטה הנפוצה היא טרום הטבעה של אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים (CLEM), מה שאומר שהדמיית LM נעשית לפני הכנת דגימת EM. כמעט כל החלבונים הפלואורסצנטיים הקיימים ניתנים לבדיקה ב-CLEM טרום הטבעה. עם זאת, בגלל העיוותים וההתכווצויות הבלתי נמנעים, יישור מדויק של התמונה הסופית אינו אפשרי6. לכן, המידע המסופק על ידי הטבעה מראש של CLEM הוא לבדוק את מבני העל של אותו תא שצולם על ידי LM בהדמיית EM.
השיטה המסופקת על ידי מחקר זה היא לאחר הטמעת CLEM, שבה הדמיית LM נעשית לאחר הכנת דגימת EM. ההתכווצות הנגרמת על ידי הקיבוע הכימי בהכנת דגימת EM אינה משפיעה על היישור המדויק של התמונה הסופית. יתר על כן, מכיוון שגם הדמיית LM וגם הדמיית EM נעשות על אותו קטע ובעזרת ננו-חלקיקי זהב, יישור התמונה הסופי יכול להיות מדויק מאוד. לאחר הטבעה של CLEM נדרש שהחלבונים הפלואורסצנטיים ישמרו על אות פלואורסצנטי לאחר הכנת דגימת EM קונבנציונלית. קודם לכן דיווחנו על החלבון הפלואורסצנטי הראשון שנקרא mEosEM, שיכול לשמור אותות פלואורסצנטיים באמצעות Epon כשרף8. בהשוואה לשרפים אחרים כשרף הטבעה, לאפון יש תכונות שימור וחתך אולטרה-מבנה מעולות. בעקבות mEosEM דווח על חלבונים פלואורסצנטיים עמידים אחרים להטמעת אפון, כגון mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 ו-HfYFP9.
על פי הניסיון שלנו, mScarlet עדיף על חלבונים פלואורסצנטיים אחרים. פתרון מקבע יכול להשפיע על פלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים. באופן כללי, מהירות תהליך הקיבוע של פרפורמלדהיד (PFA) איטית בהרבה מזו של גלוטראלדהיד (GA); לעומת זאת, PFA חודר לדגימה מהר יותר מאשר GA גדול יותר. תערובת של PFA ו-GA מספקת איזון בין קיבוע הדגימה במהירות מספקת כדי שאיכותה תישמר, אך לאט מספיק כדי שלא יתרחש נזק לדגימה, כגון חמצון. ריכוז GA גבוה יותר יפיק אוטופלואורסצנטיות גבוהה יותר. מניסיוננו, ניתן לזהות את הפלואורסצנטיות של mScarlet בבלוק שרף 6 חודשים לאחר פילמור. אך אנו ממליצים לבצע הדמיית CLEM מיד לאחר פילמור.
גורם מפתח נוסף בהטמעת CLEM לאחר מכן הוא כיצד לרשום את תמונת LM עם תמונת EM בצורה מדויקת. בהתבסס על שיטות 6,21 שדווחו בעבר, ביצענו כמה שינויים בפרוטוקול. הראשון הוא כיצד למצוא את אותו תא שצולם על ידי LM בהדמיית EM. לקחנו FOV שונים כדי לתפור את מפת הניווט של כל החלק האולטרה דק באמצעות מצב DIC והדמיה פלואורסצנטית. באמצעות מפת הניווט ניתן היה לזהות בקלות את התאים המעניינים. שיפור נוסף הוא יישור תמונה מדויק. בעבר, השתמשנו באות פלואורסצנטי במצב הדמיה פלואורסצנטית ובאות ניגודיות אלקטרונים גבוהה במצב הדמיה אלקטרומגנטית של ננו-חלקיקי הזהב כסמני היישור הפידוקיאליים6. עם זאת, בעת השימוש ב-mScarlet, האות הפלואורסצנטי של mScarlet היה גבוה בהרבה מהאות הפלואורסצנטי של ננו-חלקיקי הזהב והיה קשה לזהות את האות הפלואורסצנטי של ננו-חלקיקי זהב. כדי לפתור בעיה זו, השתמשנו באות השדה הבהיר של ננו-חלקיקי הזהב לרישום במקום האות הפלואורסצנטי. בעקבות פרוטוקול שונה זה, היה קל לבצע CLEM לאחר הטבעה.
עם זאת, ישנן כמה מגבלות של הפרוטוקול הנוכחי, אשר יש לקחת בחשבון לפני השימוש בו. למרות שזה עובד היטב במערכת ביטוי יתר, הפלואורסצנטיות היא די חלשה אם חלבוני המטרה נמצאים תחת המקדם המקורי שלהם22. מגבלה נוספת היא שלמרות שסקרלט הוא החלבון הפלואורסצנטי הטוב ביותר (על פי הניסיון שלנו) שיכול לשמור מספיק אותות פלואורסצנטיים לאחר הכנת דגימת EM ועובד היטב בתאי יונקים, זו תהיה בעיה בעת שימוש ב- mScarlet כתג פלואורסצנטי בנוירונים, מה שיכול להוביל למיקום שגוי של חלבוני המטרה15. במקרים אלה, אנו מציעים להשתמש ב-oScarlet15, מוטציה של mScarlet, אשר פועלת היטב בתאי עצב.
ניתן לחלק את היישומים הפוטנציאליים של פרוטוקול שונה זה לשתי קטגוריות. הראשונה היא להתקרב לרמה התת-תאית, כלומר לחקור את חלבון המטרה בהקשר התת-תאי. בדוחות שפורסמו בעבר, השתמשנו ב-CLEM לאחר הטבעה כדי לבחון את היווצרותם של תאי הרכבה ציטופלזמיים של נגיפים (cVACs) במהלך הדבקה על-ידי וירוס γ-הרפס23. ביישומים עתידיים, ניתן לשלב CLEM לאחר הטבעה עם טומוגרפיית אלקטרונים כדי להשיג את ההתפלגות התלת-ממדית של חלבוני המטרה ולפתור את המבנה התלת-ממדי באופן מקורי24. הסוג השני של יישום פוטנציאלי הוא זום אאוט לרמה התאית, אשר ניתן להשתמש בו כדי לצייר ולנתח מעגלים עצביים. בשל יכולת הרזולוציה הגבוהה שלו, EM הפך לאמצעי יעיל למיפוי קשרים מוחיים עדינים. עם זאת, EM אינו יכול לספק במדויק את הזהויות של נוירונים, מה שמגביל את הניתוח המעמיק של המעגל העצבי. ל-CLEM לאחר ההטבעה של Epon יש פוטנציאל להביא את הזהויות של תאי עצב לתוך המעגל העצבי מבלי לפגוע באולטרה-מבנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32201235 לז'יפיי פו), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג'יאן, סין (2022J01287 לז'יפיי פו), קרן המחקר לכישרונות מתקדמים באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן, סין (XRCZX2021013 לז'יפיי פו), הקרן הפיננסית למדע מיוחד של מחוז פוג'יאן, סין (22SCZZX002 לז'יפיי פו), קרן מעבדת המפתח של NHC להערכה טכנית של ויסות פוריות עבור פרימאט לא אנושי, ובית החולים ליולדות ובריאות הילד פוג'יאן (2022-NHP-04 לז'יפיי פו). אנו מודים לליניינג ג'ואו, מינשיה וו, שי לין ויאן הו במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על התמיכה בהכנת דגימות EM והדמיית EM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
