Overview
本文描述了从斑马鱼尾夹中提取的DNA。该协议展示了一种快速高效的方法来分析斑马鱼的基因型。
Protocol
1. 脱氧核糖核酸制备
- 准备DNA裂解缓冲:50米KCl,10米特里斯-HCl pH 8.3,0.3%补间20,0.3%NP40。在使用当天加入新鲜蛋白酶 K,最终浓度为 1 毫克/毫升。
- 组织收集:
- 对于成人鱼翅夹:
- 麻醉鱼:将鱼放在0.004%MS-222(三卡因)溶液中。等到刺运动减慢。
- 将鱼放在一叠 5-10 Kimwipes 上,用无菌剃须刀刀片切开一小块约 2-3 毫米的尾鳍。
- 迅速将鱼放在贴有淡水的标签水箱中,以进行恢复:仔细标记罐和相应的管,将包含鳍夹。换水每隔一天喂一次鱼。
- 用无菌移液器尖端拾取鳍夹,并将其转移到装满 100 μl DNA 裂解缓冲器的管中。
- 丢弃移液器尖端,并将剃须刀刀片丢弃到锋利的容器中。
- 对于胚胎尾夹:
- 将胚胎放入 0.004% MS-222 (三卡因) 溶液中。等待2分钟。
- 在解剖显微镜下用钳子切一条尾巴。
- 将尾部放入一个贴有标签的管子中,该管中充满 30μl DNA 裂解缓冲器。
- 迅速将胚胎放入含有100微克4%副甲醛的管子里。
- 带有胚胎及其相应尾管的标签管。
- 将带有胚胎的管子存放在 4 °C 过夜进行固定。
- 使用米利-Q水和每个胚胎之间的金钳清洁钳子,以尽量减少污染。
- 对于整个胚胎:
- 将胚胎放入 0.004% MS-222 (三卡因) 溶液中。等待2分钟。
- 将1-5个胚胎放入充满100μlDNA裂解缓冲器的管子里。没有必要去劝告。
- 对于成人鱼翅夹:
- 脱氧核糖核酸消化
在 55 °C 处用组织(鳍或尾夹或胚胎)孵化管,长达 4 小时,直至过夜。 - 灭活蛋白酶 K
加热管至 95 °C 15 分钟。 DNA 应立即用于 PCR,或储存在 -20 °C 长达 3 个月。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
Tricaine | |||
Paraformaldehyde |