阿加安装：安装活斑马鱼胚胎进行长期成像的基本方法

Overview

此视频描述了使用低熔性蔗糖在 6 个井板上安装活斑马鱼胚胎的分步说明。它还提供了获取活胚胎图像并使用软件分析活胚胎的过程。

Protocol

1. 显微镜设置、图像采集、处理和分析

1. 准备 0.8% 低熔点 （LMP） agarose： 将 0.8 g LMP agarose 添加到 100 毫升 E3 中，加热至完全溶解。当热，阿利奎特1毫升的LMP阿加罗斯成1.5毫升微胶管在37°C加热块。LMP 阿加罗斯将保持熔融在 37 °C。 在 37 °C 的每 1 毫升 LMP agaquot 中加入 40 微克 4 毫克/毫升 （25 倍），pH 7.0 三卡因 。 注意： 如果与色素菌株配合工作，在每 1 毫升别名中加入 20 μl 的 0.15% （50 倍） PTU。
   1. 在 4 °C 的密封 50 毫升管中存储剩余的 LMP agarose 几个月。
2. 麻醉寄生虫胚胎，通过添加1毫升4毫克/毫升（25倍），pH 7.0三卡因到25毫升的E3，胚胎已经在图像。
3. 轻轻旋转盘子，使胚胎在中间汇集。然后，使用宽尖塑料转移移液器，用尽可能少的液体提取胚胎。将移液器直立，轻轻弹跳胚胎，使胚胎沉淀到移液器的底部。
   1. 将胚胎放在移液器底部，通过轻轻触摸移液器尖端到浮子表面，将它们转移到1毫升的LMP agarose中。避免转移多余的液体，因为这将稀释糖。
4. 从移液器中排出多余的液体后，使用移液器轻轻混合浮子内的胚胎，然后使用移液器将所有糖和胚胎转移到玻璃底（1.5号盖片）、6井板的井中。
   注： 将胚胎转移到成像板后，一定要丢弃移液器。残留的蔗糖将设置在移液器内，使其无效，无法进一步使用。相反，每次使用新的移液器。
5. 在立体镜下，使用固定在木制调戏针末端的凝胶加载移液器尖端将胚胎定位到盖玻璃（以确保它们位于显微镜目标的工作距离内）和成像所需的方向。
   注： 不断重新定位，直到阿加罗斯完全设置。注意安装对羟核生物胚胎，根据该胚胎的对被成像。鉴于连体胚胎的随机方向，对于某些对，可能很难对两个胚胎进行成像。在这种情况下，使用钳子和宽尖塑料转移移液器从糖体中恢复胚胎，然后从不同的角度重新安装成像。
6. 一旦阿加罗斯设置， 覆盖 2 - 3 毫升的 E3 补充三卡因 （和 Ptu 如果必要的话） 。
7. 使用倒置的宽场表观荧光、激光扫描共焦或旋转圆盘共焦显微镜对胚胎进行成像。选择最适合所需成像的目标。对于整个胚胎视场，使用 4 倍目标。选择更高的放大倍数（如 20 倍目标）来映像特定组织
   注： 如果使用直立显微镜，在玻璃盖滑道上安装 LMP agarose（类似于上图）。将玻璃盖翻转到玻璃显微镜滑梯上，滑梯上装有一环真空油脂，并填充相同的 E3-三角-PTU。
8. 使用免费图像分析软件包（如 NIH 图像 J/FIJI）处理获取的图像。
   注： 使用细分和跟踪算法计算细胞数量并量化动态，如细胞迁移和细胞分裂。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000