Montaggio Agar: un metodo di base per il montaggio di embrioni zebrafish vivi per l'imaging a lungo termine

Overview

Questo video descrive le istruzioni passo dopo passo sul montaggio di embrioni di zebrafish vivi su 6 piastre di pozzo utilizzando agarosio a bassa fusione. Fornisce anche il processo per acquisire immagini di embrioni vivi e analizzarli utilizzando il software.

Protocol

1. Configurazione del microscopio, acquisizione, elaborazione e analisi delle immagini

1. Preparare l'agarosio a basso punto di fusione (LMP) dello 0,8%: Aggiungere 0,8 g di agarosio LMP a 100 ml E3 e riscaldare fino a completo scioglimento. Mentre è caldo, aliquota 1 ml di agarosio LMP in tubi di microfugo da 1,5 ml in un blocco riscaldante a 37 °C. L'agarosio LMP rimarrà fuso a 37 °C. Aggiungere 40 μl di 4 mg/ml (25x), pH 7,0 tricaina a ciascuna aliquota di 1 ml di agarosio LMP a 37 °C. NOTA: Se si lavora con un ceppo pigmentato, aggiungere 20 μl di 0,15% (50x) PTU a ciascuna aliquota da 1 ml.
   1. Conservare l'agarosio LMP rimanente per diversi mesi in tubi sigillati da 50 ml a 4 °C.
2. Anestetizzare embrioni parabiotici da imageizzare aggiungendo 1 ml di 4 mg/ml (25x), pH 7,0 tricaina ai 25 ml di E3 in cui si trovano già gli embrioni.
3. Ruota delicatamente il piatto in modo che gli embrioni si uniranno nel mezzo. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica a punta larga, redigere gli embrioni nel meno liquido possibile. Ruotare la pipetta in posizione verticale e far rimbalzare delicatamente gli embrioni in modo che si sistemino sul fondo della pipetta.
   1. Con gli embrioni nella parte inferiore della pipetta, trasferirli in un'aliquota di 1 ml di agarosio LMP toccando leggermente la punta della pipetta sulla superficie dell'agarosio. Evitare di trasferire il liquido in eccesso in quanto ciò diluirà l'agarosio.
4. Dopo aver espulso il liquido in eccesso dalla pipetta, utilizzare la pipetta per mescolare delicatamente gli embrioni all'interno dell'agarosio, quindi utilizzare la pipetta per trasferire tutto l'agarosio e gli embrioni al pozzo di un fondo di vetro (n. 1.5 coverslip), piastra da 6 pozzi.
   NOTA: Assicurarsi di scartare la pipetta dopo aver trasferito gli embrioni sulla piastra di imaging. L'agarosio residuo si imposta all'interno della pipetta, rendendola inefficace per un ulteriore utilizzo. Piuttosto, usa una nuova pipetta ogni volta.
5. Sotto uno stereoscopio, utilizzare una punta di pipetta a caricamento in gel fissata all'estremità di un ago da presa in giro maneggiato in legno per posizionare gli embrioni verso il vetro di copertura (per assicurarsi che si trovano entro la distanza di lavoro dall'obiettivo del microscopio) e nell'orientamento desiderato per l'imaging.
   NOTA: Riposizionarsi continuamente fino a quando l'agarosio non è completamente impostato. Fai attenzione a montare gli embrioni parabiotici in base a quale embrione della coppia deve essere immaginato. Dato l'orientamento casuale degli embrioni congiunti, per alcune coppie può essere difficile immaginare entrambi gli embrioni. In questo scenario, recuperare gli embrioni dall'agarosio utilizzando le forcep e una pipetta di trasferimento in plastica a punta larga e quindi rimontare per l'imaging da una prospettiva diversa.
6. Una volta impostato l'agarosio, coprire con 2 - 3 ml di E3 integrato con tricaina (e PTU se necessario).
7. Immagini gli embrioni usando un'epifluorescenza a campo largo invertita, un confocale a scansione laser o un microscopio confocale a disco rotante. Selezionare l'obiettivo più appropriato per l'imaging desiderato. Per un campo visivo embrionale intero, utilizzare un obiettivo 4x. Selezionare un ingrandimento più elevato, ad esempio un obiettivo 20x, per immagini un tessuto specifico
   NOTA: Se si utilizza un microscopio verticale, montare in agarosio LMP (simile a sopra) su una copertura di vetro. Invertire il coperchio del vetro su un vetrino da microscopio che ha un anello di grasso sottovuoto riempito con lo stesso E3-tricaina-PTU.
8. Elabora le immagini acquisite utilizzando pacchetti software di analisi delle immagini gratuiti come NIH Image J / FIJI.
   NOTA: Contare i numeri di cella e quantificare dinamiche come la migrazione delle celle e la divisione cellulare utilizzando algoritmi di segmentazione e tracciamento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000