Agar Montering: En grundlæggende metode til montering af levende zebrafisk embryoner til langsigtet Imaging

Overview

Denne video beskriver trin for trin instruktioner om montering levende zebrafisk embryoner på 6 godt plade ved hjælp af lav smelte agarose. Det giver også processen til at erhverve billeder af levende embryoner og analysere det ved hjælp af software.

Protocol

1. Mikroskopopsætning, Billederhvervelse, behandling og analyse

1. Forbered 0,8% lavt smeltepunkt (LMP) agarose: Tilsæt 0,8 g LMP agarose til 100 ml E3 og opvarm indtil det er helt opløst. Mens der er varmt, aliquot 1 ml LMP agarose i 1,5 ml mikrofugerør i en 37 °C varmeblok. LMP agarose forbliver smeltet ved 37 °C. Der tilsættes 40 μl 4 mg/ml (25x), pH 7,0 trikain til hver 1 ml aliquot LMP agarose ved 37 °C. BEMÆRK: Hvis der arbejdes med en pigmenteret stamme, tilsættes 20 μl 0,15% (50x) PTU til hver 1 ml aliquot.
   1. De resterende LMP-agarose opbevares i flere måneder i forseglede 50 ml rør ved 4 °C.
2. Bedøve parabiotiske embryoner, der skal afbildes, ved at tilsætte 1 ml 4 mg/ml (25x), pH 7,0 trikain til de 25 ml E3, som embryonerne allerede befinder sig i.
3. Hvirvl forsigtigt skålen, så embryonerne vil samle sig i midten. Derefter, ved hjælp af en bredspidset plastoverførselspipette, skal du trække embryonerne i så lidt væske som muligt. Drej pipetten oprejst og forsigtigt hoppe embryonerne, så de sætter sig til bunden af pipetten.
   1. Med embryonerne i bunden af pipetten overføres de til en 1 ml aliquot af LMP agarose ved let at røre pipettespidsen til overfladen af agarose. Undgå at overføre overskydende væske, da dette vil fortynde agarose.
4. Efter at have udvist den overskydende væske fra pipetten, skal du bruge pipetten til forsigtigt at blande embryonerne i agarose, og brug derefter pipetten til at overføre alle agarose og embryoner til brønden af en glasbund (nr. 1.5 coverslip), 6-brønds plade.
   BEMÆRK: Sørg for at kassere pipetten efter overførsel af embryonerne til billedpladen. Rest agarose vil sætte inde i pipetten, hvilket gør det ineffektivt til videre brug. Brug snarere en ny pipette hver gang.
5. Under et stereoskop skal du bruge en gel-loading pipettespids, der er fastgjort på enden af en drillepind med træ, til at placere embryonerne ned mod dækglasset (for at sikre, at de er inden for mikroskopmålets arbejdsafstand) og i den ønskede billedretning.
   BEMÆRK: Flyt kontinuerligt, indtil agarose er helt indstillet. Sørg for at montere de parabiotiske embryoner, hvorefter parrets foster skal afbildes. I betragtning af den tilfældige orientering af de sammenvoksede embryoner kan det for nogle par være svært at forestille sig begge embryoner. I dette scenarie skal du genvinde embryonerne fra agarose ved hjælp af pincet og en bredspidset plastoverførselspipette og derefter remount til billeddannelse fra et andet perspektiv.
6. Når agarose er indstillet, dække med 2 - 3 ml E3 suppleret med tricain (og PTU hvis det er nødvendigt).
7. Billede embryonerne ved hjælp af en omvendt wide-field epi-fluorescens, laser-scanning confocal, eller spinning disk confocal mikroskop. Vælg den målsætning, der passer bedst til den ønskede billedbehandling. For en hel-embryon synsfelt, bruge en 4x mål. Vælg en højere forstørrelse, f.eks.
   BEMÆRK: Hvis du bruger en opretstående mikroskop, monteres i LMP agarose (svarende til ovenfor) på et glas dække slip. Vend glasset coverlip på et glas mikroskop dias, der har en ring af vakuum fedt fyldt med samme E3-tricaine-PTU.
8. Behandl erhvervede billeder ved hjælp af gratis billedanalysesoftwarepakker som NIH Image J/FIJI.
   BEMÆRK: Tæl cellenumre, og kvantificer dynamik, f.eks.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000