Montaje de agar: Un método básico de montaje de embriones de pez cebra vivo para imágenes a largo plazo

Overview

Este video describe instrucciones paso a paso sobre el montaje de embriones de pez cebra vivo en 6 placas de pozo utilizando agarose de fusión baja. También proporciona el proceso para adquirir imágenes de embriones vivos y analizarlo utilizando software.

Protocol

1. Configuración de microscopios, adquisición de imágenes, procesamiento y análisis

1. Preparar 0.8% punto de fusión bajo (LMP) de agarose: Añadir 0.8 g LMP de agarose a 100 ml E3 y calentar hasta que se disuelva por completo. Mientras que caliente, aliquot 1 ml de LMP se agarose en tubos de microfugio de 1,5 ml en un bloque de calentamiento de 37 °C. La agarose LMP permanecerá fundida a 37 °C. Añadir 40 μl de 4 mg/ml (25x), pH 7.0 tricaine a cada 1 ml de agarose LMP a 37 °C. NOTA: Si trabaja con una cepa pigmentada, agregue 20 μl de 0.15% (50x) PTU a cada 1ml de alícuota.
   1. Almacene la agarose LMP restante durante varios meses en tubos sellados de 50 ml a 4 °C.
2. Anestesteizar embriones parabióticos a ser imagen añadiendo 1 ml de 4 mg/ml (25x), pH 7.0 tricaina a los 25 ml de E3 en los que ya están los embriones.
3. Arremolina suavemente el plato para que los embriones se acumule en el medio. Luego, usando una pipeta de transferencia de plástico de punta ancha, elabore los embriones en el menor líquido posible. Gire la pipeta erguida y rebote suavemente los embriones para que se asienten en el fondo de la pipeta.
   1. Con los embriones en la parte inferior de la pipeta, transfiéralos a una alícuota de 1 ml de LMP agarose tocando ligeramente la punta de la pipeta a la superficie de la agarose. Evite transferir el exceso de líquido, ya que esto diluirá la agarose.
4. Después de expulsar el exceso de líquido de la pipeta, utilice la pipeta para mezclar suavemente los embriones dentro de la agarose, luego use la pipeta para transferir toda la agarose y los embriones al pozo de un fondo de vidrio (Nº 1.5 cubrecoche), placa de 6 pozos.
   NOTA: Asegúrese de desechar la pipeta después de transferir los embriones a la placa de diagnóstico por imágenes. La agarose residual se establecerá dentro de la pipeta, por lo que es ineficaz para su uso posterior. Más bien, usa una pipeta nueva cada vez.
5. Bajo un estereoscopio, utilice una punta de pipeta de carga en gel fijada en el extremo de una aguja de burla manipulada con madera para colocar los embriones hacia el vidrio de la cubierta (para asegurarse de que están dentro de la distancia de trabajo del objetivo del microscopio) y en la orientación deseada para la toma de imágenes.
   NOTA: Reposicione continuamente hasta que la agarose se haya ajustado por completo. Tenga cuidado de montar los embriones parabióticos según los cuales el embrión de la pareja debe ser imagen. Dada la orientación aleatoria de los embriones unidos, para algunos pares puede ser difícil imaginar ambos embriones. En este escenario, recuperar los embriones de la agarose usando fórceps y una pipeta de transferencia de plástico de punta ancha y luego volver a montar para obtener imágenes desde una perspectiva diferente.
6. Una vez que la agarose se ha ajustado, cubrir con 2 - 3 ml de E3 complementado con tricaina (y PTU si es necesario).
7. Imagine los embriones utilizando un epi-fluorescencia de campo ancho invertido, confocal de escaneo láser o microscopio confocal de disco giratorio. Seleccione el objetivo más adecuado para las imágenes deseadas. Para un campo de visión de todo el embrión, utilice un objetivo 4x. Seleccione una ampliación más alta, como un objetivo de 20x, para tomar imágenes de un tejido específico
   NOTA: Si utiliza un microscopio vertical, monte en agarose LMP (similar al anterior) en un resbalón de cubierta de vidrio. Invierta el tubo de cubierta de vidrio en un portaobjetos de microscopio de vidrio que tiene un anillo de grasa de vacío lleno con el mismo E3-tricaine-PTU.
8. Procesa imágenes adquiridas utilizando paquetes de software de análisis de imágenes gratuitos como NIH Image J/FIJI.
   NOTA: Cuente los números de celda y cuantifique dinámicas como la migración celular y la división celular mediante algoritmos de segmentación y seguimiento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000