Montagem de Ágar: Um método básico de montagem de embriões de zebrafish vivos para imagens de longo prazo

Overview

Este vídeo descreve instruções passo a passo sobre a montagem de embriões de zebrafish vivos em 6 placas de poço usando baixa ágarose derretido. Ele também fornece o processo para adquirir imagens de embriões vivos e analisá-lo usando software.

Protocol

1. Configuração de microscópio, Aquisição de Imagens, Processamento e Análise

1. Prepare 0,8% de baixo ponto de fusão (LMP) agarose: Adicione 0,8 g LMP agarose a 100 ml E3 e aqueça até dissolver totalmente. Enquanto quente, aliquot 1 ml de LMP agarose em tubos de microfugem de 1,5 ml em um bloco de aquecimento de 37 °C. A agarose LMP permanecerá derretida a 37 °C. Adicione 40 μl de 4 mg/ml (25x), pH 7,0 tricaine a cada 1 ml de LMP agarose a 37 °C. NOTA: Se trabalhar com uma cepa pigmentada, adicione 20 μl de 0,15% (50x) PTU a cada alíquota de 1ml.
   1. Armazene o restante da Agarose LMP por vários meses em tubos selados de 50 ml a 4 °C.
2. Anesthetize embriões parabióticos a serem imagens adicionando 1 ml de 4 mg/ml (25x), pH 7.0 tricaine aos 25 ml de E3 em que os embriões já estão.
3. Gire suavemente o prato para que os embriões se acumulem no meio. Em seguida, usando uma pipeta de transferência de plástico de ponta larga, elasenhe os embriões o mínimo de líquido possível. Vire a pipeta e recorta suavemente os embriões para que se acomodem na parte inferior da pipeta.
   1. Com os embriões na parte inferior da pipeta, transfira-os para uma alíquota de 1 ml de LMP agarose tocando levemente a ponta da pipeta para a superfície da agarose. Evite transferir o excesso de líquido, pois isso diluirá a ágarose.
4. Depois de expulsar o excesso de líquido da pipeta, use a pipeta para misturar suavemente os embriões dentro da agarose, em seguida, use a pipeta para transferir todas as agaroses e embriões para o poço de um fundo de vidro (nº 1,5 tampas), placa de 6 poços.
   NOTA: Certifique-se de descartar a pipeta depois de transferir os embriões para a placa de imagem. A agarose residual será colocado dentro da pipeta, tornando-a ineficaz para uso posterior. Em vez disso, use uma nova pipeta cada vez.
5. Sob um estereoscópio, use uma ponta de pipeta de carregamento de gel fixada na extremidade de uma agulha de provocação manuseada em madeira para posicionar os embriões em direção ao vidro de cobertura (para garantir que eles estejam dentro da distância de trabalho do objetivo do microscópio) e na orientação desejada para a imagem.
   NOTA: Reposicione-se continuamente até que a agarose esteja totalmente definida. Tome cuidado para montar os embriões parabióticos de acordo com qual embrião do par deve ser imageado. Dada a orientação aleatória dos embriões unidos, para alguns pares pode ser difícil imaginar ambos os embriões. Neste cenário, recupere os embriões da agarose usando fórceps e uma pipeta de transferência de plástico de ponta larga e, em seguida, remonta para imagem de uma perspectiva diferente.
6. Uma vez definida a agarose, cubra com 2 - 3 ml de E3 complementado com tricaine (e PTU, se necessário).
7. Imagem dos embriões usando uma epi-fluorescência de campo largo invertido, confocescação de escaneamento a laser ou microscópio confocal de disco giratório. Selecione o objetivo mais adequado para a imagem desejada. Para um campo de visão de embriões inteiros, use um objetivo 4x. Selecione uma ampliação mais alta, como um objetivo de 20x, para imaginar um tecido específico
   NOTA: Se usar um microscópio vertical, monte em Agarose LMP (semelhante a acima) em um deslizamento de tampa de vidro. Inverta a tampa de vidro em um slide de microscópio de vidro que tem um anel de graxa de vácuo preenchido com o mesmo E3-tricaine-PTU.
8. Processar imagens adquiridas usando pacotes gratuitos de software de análise de imagens, como NIH Image J/FIJI.
   NOTA: Conte números de células e quantifique dinâmicas como migração celular e divisão celular usando algoritmos de segmentação e rastreamento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000