का उत्पादन सी. एलिगेंस Recombineering के साथ के माध्यम से transgenes GalK चयन मार्कर
Summary
के लिए transgenes उत्पादन करने की क्षमता<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em> जीनोमिक fosmids द्वारा किए गए डीएनए का उपयोग विशेष रूप से आकर्षक है के रूप में देशी नियामक तत्वों के सभी को बरकरार रखा हो रहे हैं. साथ recombineering के माध्यम transgenes के उत्पादन के लिए एक सरल और मजबूत प्रक्रिया में वर्णित<em> GalK</em> चयन मार्कर.
Abstract
ट्रांसजेनिक जानवर के निर्माण सी. में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है एलिगेंस अनुसंधान सहित GFP संलयन प्रोटीन का उपयोग करने के विनियमन और ब्याज या अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि की पीढ़ी (नल) विशिष्ट जीन की संस्करण उनके शुद्धीकरण की सुविधा के लिए टैग के जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन . आमतौर पर transgenes एक प्रमोटर एक GFP रिपोर्टर जीन या ब्याज की सीडीएनए के ऊपर रखकर उत्पन्न कर रहे हैं, और इस बार एक प्रतिनिधि अभिव्यक्ति पैटर्न का उत्पादन. हालांकि, 3 'untranslated क्षेत्र या वैकल्पिक प्रमोटरों में नियंत्रण तत्व के रूप में जीन विनियमन के महत्वपूर्ण तत्व, इस दृष्टिकोण से याद किया जा सकता है. इसके अलावा केवल एक एकल ब्याह संस्करण आम तौर पर इस तरह से अध्ययन किया जा सकता है. इसके विपरीत, fosmid डीएनए क्लोन द्वारा किए कीड़ा जीनोमिक डीएनए के उपयोग की संभावना शामिल सबसे जो अधिक से अधिक वास्तविक अभिव्यक्ति पैटर्न और समय पर कब्जा करने की क्षमता परमिट vivo में जीन विनियमन में शामिल सभी तत्वों अगर नहीं. Fosmid डीएनए का उपयोग कर transgenes की पीढ़ी की सुविधा के लिए, हम एक ई. वर्णन कोलाई recombineering GFP, एक नल टैग, या हित के अन्य दृश्यों जीन में किसी भी स्थान में सम्मिलित प्रक्रिया आधारित है. प्रक्रिया चयन मार्कर के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक दोनों recombineering में चयन कदम है जो उच्च दक्षता के साथ वांछित संशोधन को प्राप्त करने में परिणाम के लिए galK जीन का उपयोग करता है. इसके अलावा, galK GFP के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया अनुरूपता हथियार द्वारा flanked और जीन नल संलयन जीन युक्त plasmids उपलब्ध है जो 50% से oligos की लागत को कम जब एक GFP या नल संलयन प्रोटीन पैदा कर रहे हैं. ये प्लास्मिड जो व्यापक पीसीआर उत्पाद शुद्धि के लिए जरूरत precludes R6K प्रतिकृति मूल का उपयोग करें. अंत में, हम भी fosmid रीढ़ जो fosmid सीधे इंजेक्शन या कीड़े में बमबारी ट्रांसजेनिक जानवर उत्पन्न की अनुमति देता है पर unc-119 मार्कर को एकीकृत करने के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन. यह वीडियो recombineering के माध्यम से इस पद्धति का उपयोग करके एक transgene पैदा करने में शामिल प्रक्रियाओं को दर्शाता है.
Protocol
Discussion
fosmids से transgenes की पीढ़ी देशी प्रमोटर तत्वों, ब्याह वेरिएंट, और 3 'UTR नियामक तत्वों के सभी बनाए रखने का लाभ प्रदान करता है. यह एक transgene है जो देशी अभिव्यक्ति पैटर्न, या जब अन्य तरीकों 5 असफल एक कार्यात्मक transgene क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों Lindsey नैश के लिए तकनीक विकसित करने के साथ मदद के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम NIH अनुदान AG028977 द्वारा ALF, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय से एक पायलट और पिट्सबर्ग OAIC विश्वविद्यालय (AG024827), और बीज धन से परियोजना अनुदान के लिए वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
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