Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker
Summary
Die Fähigkeit, Transgene für produzieren<em> Caenorhabditis elegans</em> Verwendung von genomischer DNA von Fosmide durchgeführt Besonders attraktiv ist wie alle nativen regulatorischen Elemente beibehalten werden. Beschrieben wird eine einfache und robuste Verfahren zur Herstellung von Transgenen über Rekombination mit dem<em> GalK</em> Selektionsmarker.
Abstract
Die Erzeugung transgener Tiere ist weit verbreitet in C genutzt elegans Forschung einschließlich der Verwendung von GFP Fusionsproteine auf die Regulation und Expression von Genen von Interesse oder die Erzeugung von Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) markierten Versionen bestimmter Gene, um ihre Reinigung zu erleichtern studieren. Typischerweise Transgene werden durch einen Promotor stromaufwärts von einem GFP-Reportergen oder cDNA von Interesse erzeugt, und dies führt oft zu einer repräsentativen Expressionsmuster. Allerdings kritischen Elemente der Genregulation, wie Steuerelemente in der 3 'untranslatierten Region oder alternative Promotoren, konnte durch diesen Ansatz fehlen. Weitere nur eine einzige Spleißvariante können in der Regel auf diese Weise untersucht werden. Im Gegensatz dazu die Verwendung von Wurm genomischer DNA von Fosmid DNA-Klone durchgeführt beinhaltet wahrscheinlich die meisten, wenn nicht alle Elemente in der Genregulation in vivo, die die größere Fähigkeit, die echten Ausdruck Muster und Timing zu erfassen erlaubt beteiligt. Zur Erleichterung der Erzeugung von Transgenen mit Fosmid DNA beschreiben wir ein E. coli basierten Recombineering Verfahren zur GFP, einem TAP-tag oder andere Sequenzen von Interesse in jeder beliebigen Stelle im Gen einzufügen. Das Verfahren nutzt die galK-Gen als Selektionsmarker für die positiven und negativen Selektion Schritte in die Rekombination in den Erhalt der gewünschten Modifikation mit hohem Wirkungsgrad zur Folge. Außerdem sind Plasmide, die die galK Gens durch Homologie Arme auf häufig verwendete GFP flankiert und TAP Fusionsgene zur Verfügung, die Reduzierung der Kosten für Oligos um 50% bei der Erzeugung eines GFP-oder TAP-Fusionsprotein. Diese Plasmide verwenden R6K Replikationsursprung, der die Notwendigkeit einer umfassenden PCR-Produkt Reinigung ausschließt. Schließlich haben wir auch zeigen, eine Technik, um die unc-119-Marker auf die Fosmid Rückgrat der die Fosmid direkt injiziert werden oder bombardiert zu Würmern, um transgene Tiere zu erzeugen erlaubt integrieren. Dieses Video zeigt die Verfahren bei der Erzeugung eines Transgens über Rekombination mit dieser Methode beteiligt.
Protocol
Discussion
Die Erzeugung von Transgenen aus Fosmide bietet den Vorteil der Beibehaltung aller von den nativen Promotor-Elemente, Splice-Varianten und 3 'UTR regulatorische Elemente. Dies kann mit dem Bau eines Transgens, das eher auf den einheimischen Ausdruck Muster oder den Bau eines funktionalen Transgen, wenn andere Ansätze 5 alle fehlschlagen wird führen können. Die daraus resultierende Transgene tragen kann eine Vielzahl von Epitop-Tags einschließlich GFP oder ein TAP-Tag.
Der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Lindsey Nash für die Hilfe bei der Entwicklung der Technik zu danken. Diese Arbeit wurde vom NIH AG028977 zu ALF, ein Pilotprojekt Zuschuss von der University of Pittsburgh OAIC (AG024827), und Anschubfinanzierung von der University of Pittsburgh finanziert.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
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