Производство С. Элеганс Трансгенов через Recombineering с GalK Выбор маркера
Summary
Способность производить трансгенов для<em> Caenorhabditis Элеганс</em> Использование геномной ДНК несет fosmids особенно привлекателен, как и все родные регуляторные элементы сохраняются. Описывается простой и надежной процедуры для производства трансгенов через recombineering с<em> GalK</em> Селективного маркера.
Abstract
Создание трансгенных животных широко применяется в C. Элеганс исследований, включая использование белков GFP слияния для изучения регуляции и экспрессии генов интересов или поколение очистки тандеме сродством (TAP) меткой версии специфических генов для облегчения их очистки. Как правило трансгенов создаются путем размещения промоутер перед геном GFP репортера или кДНК, представляющих интерес, и это часто приводит к представителю выражению. Тем не менее, критические элементы регуляции генов, таких как элементы управления в нетранслируемой области 3 'или альтернативных промоторов, может не хватать такого подхода. Далее только один вариант сплайсинга могут быть изучены обычно это означает. В противоположность этому, использование червя геномной ДНК несет клонов ДНК fosmid вероятно, включает в себя большинство, если не все элементы, участвующие в регуляции генов в естественных условиях, которая позволяет более широкие возможности для захвата подлинной выражению и сроки. Для облегчения поколения трансгенов использованием fosmid ДНК, мы описываем Е. кишечной основан recombineering процедуры для вставки GFP, TAP-тег, или другие последовательности интереса в любом месте в геном. Процедура использует galK гена как выбор маркера для позитивной и негативной селекции шаги в recombineering что приводит к получению желаемого модификация с высокой эффективностью. Кроме того, плазмиды, содержащие ген galK окружении гомологии оружия обычно используются GFP и TAP слияние генов доступны, которые снижают стоимость олигонуклеотидов на 50% при генерации или белка GFP TAP синтеза. Эти плазмиды использовать происхождения R6K репликации что исключает необходимость широкого очистки продуктов ПЦР. Наконец, мы также продемонстрировать технику для интеграции UNC-119 маркеров на fosmid основу, которая позволяет fosmid напрямую вводили или бомбардировке в червей для получения трансгенных животных. Это видео демонстрирует процедур, необходимых для создания трансгенных через recombineering используя этот метод.
Protocol
Discussion
Поколения трансгенов из fosmids предлагает благо сохраняя все родную стихию промоутер, сращивание вариантов, и 3 'UTR регуляторных элементов. Это может привести к строительству трансгенов которая в большей степени соответствовали родной выражению, или строительство функциональных тран?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Линдси Нэш за помощь в развитии техники. Эта работа финансировалась NIH грант AG028977 для ALF, грант пилотного проекта из Университета Питтсбурга OAIC (AG024827), а также семян средств из Университета Питтсбурга.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
