لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر
Summary
القدرة على إنتاج لالجينات المحورة<em> انواع معينة ايليجانس</em> الجينومية باستخدام الحمض النووي التي يحملها fosmids على جاذبية خاصة حيث يتم الاحتفاظ بكافة العناصر التنظيمية المحلية. ووصف هو إجراء بسيط وفعال للانتاج عن طريق الجينات المحورة مع recombineering<em> galK</em> علامة اختيار.
Abstract
ويستخدم على نطاق واسع خلق الحيوانات المعدلة وراثيا في C. ايليجانس البحوث بما في ذلك استخدام البروتينات الانصهار GFP لدراسة نمط التنظيم والتعبير عن الجينات في المصالح أو جيل من تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) الموسومة إصدارات جينات محددة لتسهيل تنقية بهم. عادة يتم إنشاؤها الجينات المحورة من خلال وضع مروج المنبع من الجين مراسل GFP [كدنا] أو المصالح ، وهذا غالبا ما ينتج عن نمط التعبير التمثيلي. ومع ذلك ، والعناصر الحاسمة لتنظيم الجينات ، مثل عناصر المراقبة في المنطقة 3 'غير مترجمة أو المروجين بديلة ، يمكن أن غاب عن هذا النهج. كذلك يمكن إلا أن يكون متغير واحد درس عادة لصق هذه الوسائل. في المقابل ، فإن استخدام الحمض النووي الجيني الدودة التي يحملها استنساخ الحمض النووي fosmid يتضمن على الأرجح إن لم يكن كل العناصر المتورطة في تنظيم الجينات في الجسم الحي الذي يسمح للمزيد من القدرة على التقاط نمط التعبير الحقيقي والتوقيت. لتسهيل توليد الجينات المحورة باستخدام الحمض النووي fosmid ، ونحن تصف E. القولونية يستند الإجراء recombineering لادخال GFP ، حنفية ، العلامة ، أو سلاسل أخرى ذات اهتمام في أي مكان في الجينات. يستخدم الإجراء الجين كما galK علامة الاختيار لكلا من اختيار الخطوات الإيجابية والسلبية في النتائج التي recombineering في الحصول على التعديل المطلوب بكفاءة عالية. مزيد من البلازميدات تحتوي على الجين galK محاط الأسلحة إلى التماثل GFP يشيع استخدامها والاستفادة من الجينات الانصهار متوفرة مما يقلل من تكلفة oligos بنسبة 50 ٪ عند توليد البروتين GFP أو TAP الانصهار. هذه البلازميدات استخدام النسخ الأصلية R6K ما يحول دون الحاجة إلى واسعة لتنقية المنتج PCR. أخيرا ، علينا أن نظهر أيضا تقنية لدمج علامة UNC – 119 إلى العمود الفقري fosmid الذي يسمح للfosmid حقنه مباشرة أو المقصوفة الديدان لتوليد حيوانات معدلة وراثيا. هذا الفيديو يوضح الإجراءات التي ينطوي عليها توليد التحوير عبر recombineering باستخدام هذا الأسلوب.
Protocol
Discussion
توليد الجينات المحورة من fosmids يقدم فائدة الاحتفاظ بجميع العناصر المروج الأصلي ، متغيرات لصق ، و 3 "العناصر UTR التنظيمية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى بناء التحوير الذي هو أكثر تعبيرا عن نمط التعبير الأصلي ، أو بناء على التحوير وظيفية عندما تفشل الأساليب الأخرى 5. يمكن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ليندسي ناش للمساعدة في تطوير هذه التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AG028977 لمؤسسة آنا ليند ، منحة المشروع التجريبي من جامعة بيتسبرغ OAIC (AG024827) ، وصناديق البذور من جامعة بيتسبرغ.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
