La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection
Summary
La capacité de produire des transgènes<em> Caenorhabditis elegans</em> En utilisant l'ADN génomique porté par fosmides est particulièrement intéressante car tous les éléments natifs réglementaires sont conservés. Décrite est une procédure simple et robuste pour la production de transgènes via recombineering avec le<em> GalK</em> Marqueur de sélection.
Abstract
La création d'animaux transgéniques est largement utilisée en C. la recherche elegans y compris l'utilisation de protéines de fusion GFP pour étudier la régulation et de profil d'expression de gènes d'intérêt ou de génération de purification d'affinité en tandem (TAP) taggés versions de gènes spécifiques pour faciliter leur purification. Typiquement transgènes sont générés en plaçant un promoteur en amont d'un gène rapporteur GFP ou de l'ADNc d'intérêt, et cela produit souvent un motif d'expression représentant. Toutefois, des éléments critiques de la régulation des gènes, tels que les éléments de contrôle dans la région 3 'non traduite ou promoteurs alternatifs, pourraient être manquées par cette approche. En outre seul un variant d'épissage unique peut être généralement étudiés par ce moyen. En revanche, l'utilisation de l'ADN génomique ver porté par des clones d'ADN fosmide inclut probablement la plupart sinon tous les éléments impliqués dans la régulation des gènes in vivo qui permet la plus grande capacité à capter le profil d'expression authentique et le calendrier. Afin de faciliter la génération de transgènes en utilisant l'ADN fosmide, nous décrivons un E. coli procédure basée sur recombineering d'insérer la GFP, un TAP-tag, ou d'autres séquences d'intérêt dans n'importe quel endroit dans le gène. La procédure utilise le gène galK comme marqueur de sélection pour les deux étapes de sélection positive et négative dans recombineering qui aboutit à l'obtention de la modification souhaitée avec une grande efficacité. En outre, des plasmides contenant le gène galK flanqué par des bras d'homologie à la GFP couramment utilisés et TAP gènes de fusion sont disponibles, qui réduisent le coût des oligos de 50% lors de la génération une protéine de fusion GFP ou TAP. Ces plasmides utiliser l'origine de réplication R6K, qui exclut la nécessité d'une purification complète de produits de PCR. Enfin, nous avons également démontrer une technique pour intégrer le marqueur unc-119 à la colonne vertébrale qui permet à l'fosmide fosmide d'être directement injectés ou bombardés en vers pour générer des animaux transgéniques. Cette vidéo montre les procédures impliquées dans la génération d'un transgène par le biais recombineering utilisant cette méthode.
Protocol
Discussion
La génération des transgènes de fosmides offre l'avantage de conserver l'ensemble des éléments promoteur natif, les variants d'épissage, et 3 'UTR éléments réglementaires. Cela peut conduire à la construction d'un transgène qui est plus représentatif de la tendance d'expression maternelle, ou la construction d'un transgène fonctionnel lorsque d'autres approches échouent 5. Les transgènes qui en résulte peut mener une série de balises épitope incluant la GFP ou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Lindsey Nash pour les aider à développer la technique. Ce travail a été financé par le NIH octroi AG028977 à Alf, une subvention de projet pilote de l'Université de Pittsburgh OAIC (AG024827), et fonds d'amorçage de l'Université de Pittsburgh.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
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