De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker
Summary
De mogelijkheid om transgenen te produceren voor<em> Caenorhabditis elegans</em> Gebruik van genomisch DNA gedragen door fosmids is vooral aantrekkelijk als alle van de inheemse regulerende elementen zijn behouden. Beschreven, is een eenvoudige en deugdelijke procedure voor de productie van transgenen via recombineering met de<em> GalK</em> Selecteerbare merker.
Abstract
Het creëren van transgene dieren wordt op grote schaal gebruikt in C. elegans onderzoek met inbegrip van het gebruik van GFP fusie-eiwitten voor de regulering en expressie patroon van de genen van belang of generatie van de tandem affiniteitszuivering (TAP) gelabelde versies van specifieke genen om hun zuivering te vergemakkelijken studie. Typisch transgenen worden gegenereerd door het plaatsen van een promotor stroomopwaarts van een GFP reporter-gen of cDNA van belang, en dit vaak levert een vertegenwoordiger expressiepatroon. Echter, kritische elementen van de genregulatie, zoals de controle-elementen in onvertaald de drie 'regio of alternatieve promotors, kan gemist worden door deze aanpak. Verder slechts een splice variant kan doorgaans worden bestudeerd langs deze weg. In tegenstelling tot het gebruik van de worm genomisch DNA gedragen door fosmid DNA-klonen bevat waarschijnlijk de meeste, zo niet alle elementen die betrokken zijn bij genregulatie in vivo waarin de groter vermogen om de echte uitdrukking patroon en de timing vast te leggen vergunningen. Ter vergemakkelijking van de generatie van transgenen via fosmid DNA, beschrijven we een E. coli op basis van recombineering procedure om GFP, een TAP-tag, of andere sequenties van belang te voegen in elke gewenste locatie in het gen. De procedure maakt gebruik van de galK gen als de selectie marker voor zowel de positieve en negatieve selectie stappen in recombineering wat resulteert in het verkrijgen van de gewenste wijziging met een hoge efficiëntie. Verder, plasmiden die de galK gen geflankeerd door homologie armen tot veelgebruikte GFP en TAP fusie-genen zijn beschikbaar die de kosten van de oligos te verminderen met 50% bij het genereren van een GFP of TAP fusie-eiwit. Deze plasmiden gebruik maken van de R6K replicatieoorsprong die de noodzaak voor uitgebreide PCR product zuivering uitsluit. Tot slot hebben we ook aantonen dat er een techniek om de unc-119 marker te integreren op de fosmid ruggengraat die het mogelijk maakt de fosmid direct worden geïnjecteerd of gebombardeerd in de wormen om transgene dieren te genereren. Deze video toont de procedures die betrokken zijn bij het genereren van een transgen via recombineering met deze methode.
Protocol
Discussion
De generatie van transgenen uit fosmids biedt het voordeel van behoud van alle van de inheemse promoter elementen, splice-varianten, en 3 'UTR regulerende elementen. Dit kan leiden tot de bouw van een transgen dat is meer een weerspiegeling van de inheemse expressie patroon, of de bouw van een functioneel transgen als andere benaderingen 5 falen. De resulterende transgenen kan dragen een groot aantal epitoop labels waaronder GFP of een TAP tag.
De bouw van transgenen in drie s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Lindsey Nash bedanken voor hun hulp met het ontwikkelen van de techniek. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie AG028977 om ALF, een pilot project subsidie van de universiteit van Pittsburgh OAIC (AG024827), en het zaad fondsen van de universiteit van Pittsburgh.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
