הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר
Summary
היכולת לייצר עבור transgenes<em> Caenorhabditis elegans</em> באמצעות הדנ"א הגנומי נישא על ידי fosmids הוא אטרקטיבי במיוחד כמו כל האלמנטים הרגולציה יליד נשמרות. המתואר הוא הליך פשוט חזקים לייצור transgenes דרך recombineering עם<em> GalK</em> סמן לבחירה.
Abstract
יצירה של חיות טרנסגניות הוא מנוצל באופן נרחב ב C. elegans המחקר כולל שימוש חלבונים GFP היתוך ללמוד את הרגולציה דפוס הביטוי של גנים של עניין או דור של טיהור זיקה טנדם (TAP) מתויג גרסאות של גנים ספציפיים על מנת להקל הטיהור שלהם. בדרך כלל transgenes נוצרות על ידי הנחת יחצן במעלה הזרם של גן ה-GFP הכתב או cDNA של עניין, ואת זה לעתים קרובות מייצר דפוס הביטוי נציג. אולם, אלמנטים קריטיים של ויסות הגנים, כגון אלמנטים לשלוט באזור מתורגמים של 3 או מקדמי חלופיים, יכול לפספס על ידי גישה זו. יתר על כן רק גרסה אחת אחוי ניתן ללמוד בדרך כלל על ידי אמצעי זה. לעומת זאת, השימוש של תולעת ה-DNA הגנומי נישא על ידי שיבוטים fosmid DNA סביר כוללת את רוב אם לא כל הגורמים המעורבים בוויסות גנים in vivo, אשר מאפשרת יכולת טובה יותר כדי ללכוד את דפוס הביטוי העיתוי אמיתי. כדי להקל על הדור של transgenes באמצעות DNA fosmid, אנו מתארים E. coli מבוסס הליך recombineering להכניס GFP, ברז, תג, או רצפי עניין אחרים לתוך מקום בגן. ההליך עושה שימוש הגן galK כסמן הבחירה הן הצעדים מבחר חיוביים ושליליים recombineering שתוצאתה השגת השינוי הרצוי עם יעילות גבוהה. יתר על כן, פלסמידים המכילים את הגן galK מוקף נשק הומולוגיה ל-GFP נפוצים TAP גנים היתוך זמינים אשר להפחית את העלות של oligos בשיעור של 50% בעת יצירת ה-GFP חלבון TAP או היתוך. פלסמידים אלה משתמשים מוצא שכפול R6K אשר מונע את הצורך לטיהור PCR נרחב של המוצר. לבסוף, אנו גם להפגין טכניקה לשלב את הסמן UNC-119 על לשדרת fosmid המאפשר fosmid להיות מוזרק ישירות לתוך תולעים או מופצצים כדי ליצור חיות טרנסגניות. וידאו זה מדגים את ההליכים הכרוכים יצירת transgene דרך recombineering באמצעות שיטה זו.
Protocol
Discussion
הדור של transgenes מ fosmids מציעה את היתרון של שמירה על כל מרכיבי מקדם הילידים, וריאנטים אחוי, ו 3 'UTR אלמנטים רגולטוריים. זה יכול להוביל להקמת transgene שהוא מהורהר יותר של דפוס הביטוי הילידים, או בנייה של transgene פונקציונלי כאשר גישות אחרות להיכשל 5. Transgenes וכתוצאה מכך יכול לש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לינדסי נאש לקבלת עזרה בפיתוח הטכניקה. עבודה זו מומנה על ידי NIH כדי להעניק AG028977 אלף, פיילוט מענק מאוניברסיטת פיטסבורג OAIC (AG024827), וקרנות זרע מאוניברסיטת פיטסבורג.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
| GoTaq | Promega | M7122 | ||
| MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
| 0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | ||
| 2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
| Biotin | Sigma | B4639 | ||
| Leucine | Sigma | L8000 | ||
| NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
| Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
| MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
| Arabinose | Sigma | A3131 | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
| Glycerol | Sigma | G2025 | ||
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
